降解黄曲霉毒素B1芽孢杆菌的分离鉴定及其特性研究

摘要：本研究旨在从不同来源的样本中分离出对黄曲霉毒素B1（AFB1）具有降解作用的芽孢杆菌，为降解AFB1的芽孢杆菌开发利用提供理论依据。采集鸡的肠道、肛拭子和土壤样本，富集后利用MYP固体培养基和初筛培养基筛选出疑似芽孢杆菌的菌落，通过分析细菌对AFB1的降解率复筛，选出对AFB1具有降解作用的菌株，通过16S rRNA测序鉴定细菌种属，然后对筛选出的芽孢杆菌的溶血性、抗生素敏感性、生长曲线、耐酸和耐胆盐性进行测试。结果显示，共筛选出20株对AFB1具有降解作用的芽孢杆菌。结合细菌测序和溶血试验结果，选择3株降解率高的地衣芽孢杆菌（S51、S48、S8-2）进行试验，结果表明，3株芽孢杆菌对多种抗生素较敏感，其中S51的生长速度最快，菌液浓度最大，对酸和胆盐的耐受性均强于另外两株菌。本研究筛选出1株对AFB1有较好降解作用的地衣芽孢杆菌，具有良好的安全性和耐受性，有望作为微生态制剂应用到AFB1降解过程中。

关键词：黄曲霉毒素B1；降解；芽孢杆菌

中图分类号：S476.1 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2024）12-0105-08

黄曲霉毒素（aflatoxin，AF）是由多种黄曲霉和寄生曲霉通过聚酮途径产生的二呋喃香豆素衍生物，目前已经分离鉴定出的AF有20多种，其中以AFB1分布最广、毒性最强。AFB1的代谢物具有急性毒性、致畸性、致突变性和致癌性。动物食入AFB1后，毒素会在体内蓄积造成急性或慢性中毒，影响动物的生长性能，损伤生殖系统、消化系统、免疫系统等，降低养殖户的经济效益。AF还存在于中毒动物的肉蛋奶中，严重威胁食品安全。近几年，随着畜禽饲养数量的不断增加，饲料消耗量也随之增多，饲料在存储运输过程中极易发生发霉变质等情况。

目前AF的解毒方法有三种：物理降解、化学降解、微生物降解。其中微生物是通过将霉菌毒素结合到其表面降解或转化为毒性较小的代谢物来起作用，相较于物理和化学方法，具有安全、高效、绿色且对动物存在益生作用等优点。芽孢杆菌因具有稳定的结构、良好的抗逆性以及具有调节免疫、增强机体对疾病的抵抗力等益生作用，在动物养殖过程中被广泛应用。Liu等给1日龄肉鸡连续灌服凝结芽孢杆菌42天，发现其可以通过改善肠道菌群、促进肉鸡肠上皮细胞再生和增强先天免疫力来保护肠黏膜屏障；Jia等研究发现，给食用黄曲霉毒素污染饲料的蛋鸡连续饲喂枯草杆菌降解产物4周，可以明显改善蛋鸡的采食量、产蛋量等生产性能；Li等研究发现，给小鼠灌喂解淀粉芽孢杆菌28天能够缓解AFB1对小鼠肝脏的损伤。基于以上研究，本试验旨在从不同来源的样品中分离具有良好安全性和耐受性的AFB1降解菌，以期为芽孢杆菌降解AFB1的研究和微生物解毒制剂的开发利用提供理论依据。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1样品来源 从济南市某市场采集不同日龄健康鸡的盲肠内容物和肛拭子样本共20份：从济南华山湖采集土壤样品10份。

1.1.2主要试剂 初筛培养基：（NH4）2SO4 5.0g，KH2PO4 2.5 g，MgSO4 1.0 g，Na2HPO4·12H2O0.5 g，CaCl2 0.1 g，琼脂15 g，蒸馏水1L，pH值7，121℃灭菌15 min，加入过滤除菌的香豆素溶液至1 g/L。LB培养基、MYP培养基和MH琼脂培养基，购自青岛海博生物技术有限公司。血平板培养基，购自环凯微生物科技有限公司。AFB1标准品，购自FERMENTEK。AFB1ELISA试剂盒，购自南京博研生物科技有限公司。DNA提取试剂盒，购自北京天根生化科技有限公司。庆大霉素、青霉素及四环素等12种药敏纸片，购自杭州微生物试剂有限公司。香豆素，购自Macklin。猪胆盐，购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2降解菌株的筛选

1.2.1初筛 将采集到的肠道和土壤样本置于50 mL的LB液体培养基中富集培养24 h，将富集后的菌液用无菌水梯度稀释至10-4、10-5、10-6，划线培养于MYP固体培养基，37℃倒置培养24 h，重复操作2次。纯化后的细菌染色后进行形态特征观察，选取疑似芽孢杆菌的菌株继续划线培养于含有香豆素的初筛培养基，选择在初筛培养基上生长良好的细菌菌液与60％的甘油1：1混合，-80℃冻存。

1.2.2复筛 挑取单个菌落接种在5 mL LB液体培养基，37℃、180 r/min培养24 h。将菌液按照5％的比例接种在50 mL LB液体培养基中进行发酵，37℃、160 r/min培养48 h。培养结束后，取980 uL发酵液与20 uL AFB1标准品（5 ug/mL）混合，使AFB1的最终浓度为100ng/mL，37℃、150 r/min避光孵育72 h。以不接种菌液的LB培养基加人20 uL的AFB1标准品作为空白对照。孵育结束，4 000 r/min低温离心5min，吸取上清液，使用AFB1 ELISA试剂盒检测菌液上清中AFB1的含量。每个菌株重复3次。AFB1降解率（％）=（对照组AFB，含量-细菌组AFB1含量）／对照组AFB1含量×100。

1.3菌株16S rRNA基因序列鉴定

利用DNA提取试剂盒提取分离菌株的基因组DNA，采用细菌16S rRNA通用引物（27F/1492R）对分离菌株的DNA进行PCR扩增。PCR反应体系（20 uL）；DNA模版1 uL，引物27F、1492R各0.4 uL，2x Taq PCR StarMix 10 uL，ddH2O 8.2 uL。PCR反应条件；94℃预变性2min；94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸2min，25个循环；72℃延伸10 min。PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳验证后，送往深圳华大基因股份有限公司测序，测序结果输入BLAST进行序列比对。

1.4菌株特性分析

1.4.1溶血试验 挑取单菌落，接种于5 mL LB液体培养基，37℃、170 r/min过夜培养。将菌液划线于血平板上，37℃倒置培养24 h，观察菌落周围是否出现溶血环。

1.4.2药敏试验 首先在LB平板上挑取芽孢杆菌，接种于LB液体培养基中，37℃培养过夜，用无菌水调整为麦氏浊度为0.5的菌悬液。用无菌棉棒蘸取菌悬液，均匀涂布于MH琼脂平板，室温放置5 min。用无菌镊子将药敏纸片贴在涂布有菌液的MH琼脂平板上并做好标记，37℃培养24h后用游标卡尺测量抑菌圈直径，根据抗生素敏感性评价标准（表1）判定结果。

1.4.3细菌生长曲线 将细菌按照5％接种量接种于LB液体培养基中，37℃、180 r/min培养72 h，每12 h用酶标仪检测菌液在波长630 nm处的吸光度，以培养时间为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制细菌生长曲线。

1.4.4细菌耐受性试验 耐酸试验：将0.5 mL分离菌悬液分别接种于pH值为1.0、2.0、3.0、4.0的4.5 mL无菌LB液体培养基中，37℃处理3h。以酸处理Oh的LB培养基作为对照。取100 uL菌液10倍稀释后，选3个稀释度平板计数。37℃恒温培养24 h后计数活菌数量，按照公式计算存活率。存活率（％）=酸处理3 h的活菌数（cfu/mL）/酸处理Oh的活菌数（cfu/mL）x100。

耐胆盐试验：挑取单菌落接种于LB液体培养基并置于摇床中37℃、180 r/min过夜培养。将0.5 mL菌悬液分别接种于4.5 mL含0.1％、0.2％、0.3％胆盐的LB液体培养基中，37℃、180r/min培养3h。以胆盐处理Oh的LB液体培养基为对照。取菌液适度稀释，进行平板计数，计算存活率。存活率（％）=胆盐处理3h的活菌数（cfu/mL）/胆盐处理Oh的活菌数（cfu/mL）×100。

1.5S51菌株降解特性

取10 mL菌株S51发酵液，4℃、10 000r/min离心10 min，分离获得上清液和菌体。菌体用无菌蒸馏水洗涤、离心，重复3次后加入10 mL无菌蒸馏水制备成S51菌悬液。按上述方法制备10 mL菌悬液，随后低温超声破碎20 min，无菌过滤制备胞内液。将S51上清液、菌悬液、胞内液分别加入AFB1，37℃孵育72 h后，检测各组AFB1降解率。

1.6数据处理与分析

试验数据用Microsoft Excel汇总后进行初步整理，利用GraphPad Prism 6.02进行One-wayANOVA分析和作图。

2结果与分析

2.1降解菌株的筛选

2.1.1初筛 利用MYP培养基共分离出73株细菌，通过形态特征观察，筛选出菌落呈乳白色、边缘不规则、显微镜下菌体呈蓝紫色杆状的革兰氏阳性菌（图1），初步判断有27株为芽孢杆菌。因香豆素的化学结构与AFB1相似，继续筛选在含有香豆素的初筛培养基上生长良好的细菌，选出20株可能对AFB1具有降解作用的细菌。

2.1.2复筛 将筛选的菌株与AFB1共培养，检测细菌对AFB，的降解率。结果（图2）显示，降解率在50％以上的有4株，分别为菌株S51、S48、S8-2、S45，对AFB，的降解率分别为61.03％、58.80％、53.18％、52.58％。

2.2菌株16S rRNA基因序列鉴定

经BLAST比对，这20株菌均为芽孢杆菌，其中地衣芽胞杆菌有10株，枯草芽孢杆菌有2株，蜡样芽孢杆菌有3株，贝莱斯芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、假真菌样芽孢杆菌各1株（表2）。

2.3菌株特性

2.3.1菌株溶血性 如图3所示，20株芽孢杆菌中，T1-1、D23-2、N2-6-2、D23-2和Z5-1的菌落周围存在溶血环，有溶血现象。结合细菌的形态特征、对AFB1的降解率、16S rRNA基因序列分析以及溶血试验结果，最终选择S51、S48和S8-2这3株地衣芽孢杆菌进行后续试验。

2.3.2菌株药敏试验 由表3可知，3株地衣芽孢杆菌均对庆大霉素、多西环素、万古霉素和环丙沙星敏感，对青霉素G、阿奇霉素和克林霉素耐药，对利福平中度敏感。其中菌株S48对8种药物敏感，对1种药物中度敏感：菌株S51对5种药物敏感，对4种药物中度敏感：菌株S8-2对4种药物敏感，对5种药物中度敏感。

2.3.3菌株生长曲线 由图4可知，S51、S48、S8-2这3株地衣芽孢杆菌均在培养24 h达到生长稳定期，其中菌株S51生长速度最快：在前12 h菌株S48的生长速度高于S8-2；在24 h之后菌株S8-2的生长速度高于S48。持续监测72 h，3株地衣芽孢杆菌的浓度均能维持在稳定水平。

2.3.4细菌耐受性 3株芽孢杆菌对不同酸度的耐受性见图5。3株芽孢杆菌的存活率随着pH值的升高而提升，其中S51菌株对不同酸性溶液的耐受性明显高于另外两株芽孢杆菌，其在pH值1.0条件下的存活率为26.06％，在pH值4.0条件下的存活率为64.12％。

3株芽孢杆菌对不同浓度胆盐溶液的耐受性见图6。胆盐对3株芽孢杆菌均有不同程度的抑制作用，并随着胆盐终浓度的升高细菌的存活率降低。S48对胆盐的耐受性最低，在0.1％和0.3％的胆盐浓度下存活率分别为32.05％和22.26％。在0.1％的胆盐浓度下S51的耐受性最高，为51.54％；在0.2％的胆盐浓度下S8-2的耐受性较高，为46.22％。

2.4S51菌株降解特性

比较菌株S51上清液、菌悬液、胞内液对AFB1的降解特性，发现上清液的降解能力最强，达61.03％，菌悬液和胞内液的降解效果相对较弱，降解率分别为10.17％和7.15％（图7）。表明菌株S51对AFB1的脱毒能力主要来源于上清液中的某种活性物质，而非吸附作用。

3讨论与结论

动物饲料大量堆积容易出现发霉变质现象，如何对饲料中的黄曲霉毒素进行解毒成为问题关键。利用微生物降解黄曲霉毒素是近些年研究较多的一种解毒方法，目前已发现的降解菌有芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌、假单胞菌和黑曲霉等。芽孢杆菌可以分泌多种酶类和蛋白，通过降解和吸附的方式将AFB1转化为低毒的或无毒的化合物达到解毒效果。本研究采集土壤以及鸡的肠道和肛拭子样本，经过富集、MYP培养基培养、革兰氏染色镜检以及含香豆素的培养基培养对分离菌进行初筛，选出20株可能对AFB1具有降解作用的细菌，经与AFB1共培养复筛发现4株芽孢杆菌（S51、S48、S8-2、S45）对AFB1的降解率在50％以上，通过16S rRNA测序鉴定均为地衣芽孢杆菌。王康从发霉的谷物中分离出2株枯草芽孢杆菌，对AFB1的降解率分别为70.65％和61.42％。细菌对AFB1的降解率与AFB1浓度、反应时间、反应温度等条件有关。Wang等从土壤中分离出1株地衣芽孢杆菌，120 h内对AFB1的降解率为89.1％。程思忠等分离出一株能够降解AFB1的贝莱斯芽孢杆菌，发现其主要通过上清液中的胞外酶发挥解毒作用。王明清等筛选出一株AFB1降解菌，其各组分中上清液的降解率最高可达91.7％。本试验进一步研究表明菌株S51降解AFB1的活性组分主要存在于胞外上清液中，该结果可为后续分析S51菌株降解AFB，的活性物质奠定基础。

安全性试验是评价细菌能否应用到动物体内的关键。细菌的溶血性是筛选菌株的先决条件，溶血阳性细菌通常被认为存在安全风险，会对宿主的健康产生威胁。通过溶血试验对筛选出的20株芽孢杆菌进行安全性评价，其中T1-1、D23-2、N2-6-2、D23-2和25-1这5株细菌菌落周围出现透明的溶血环，表明存在溶血现象。结合细菌的复筛结果和菌种测序结果，最终选取3株菌进行后续试验，分别是S51、S48、S8-2。益生菌对抗生素的敏感性也是评价细菌安全性的重要指标之一。细菌对抗生索的耐药性既可以是特定物种所固有的，也可以通过基因突变或水平基因转移获得。携带耐药基因较少的菌株进入动物体内，其耐药基因转移的风险也会随之减少。药敏试验结果显示3株菌均对庆大霉素、多西环素、万古霉素和环丙沙星敏感，对青霉索G、阿奇霉素和克林霉素耐药，对利福平中度敏感。这与地衣芽孢杆菌对克林霉素的耐药性是固有特性且与其耐药基因有关的报道相一致。

对S51、S48、S8-2这3株地衣芽孢杆菌生长性能的监测结果显示，在24 h内均能达到生长稳定期，其中S51菌株生长最快，细菌浓度最大；连续培养72 h，S51的细菌数量略有下降，菌株S48和S8-2的细菌数量略有升高，但3株细菌的数量均能够维持在稳定水平，暗示芽孢杆菌进入动物体内后可以持续发挥降解作用。

能够在胃和小肠的恶劣环境中生存是益生菌所需的特性之一。益生菌进入机体后，首先会在胃内停留3h，动物胃肠道的pH值为1.5-4.0，经过胃酸的消化后益生菌进入小肠，由胆盐形成的高渗透环境会改变细胞外膜的通透性从而起到杀菌作用，胆盐浓度为0.03％-0.30％。对酸和胆盐的耐受能力直接影响益生菌能否在动物体内存活。通过对3株地衣芽孢杆菌进行耐受性试验发现，即使pH值为1.0的强酸情况下，3株菌仍能保持一定的活性，其中菌株S51的存活率能达到20％以上，在pH值4.0的情况下S51的存活率可以达到60％以上，表明其对酸的耐受性较强，能够通过胃酸消化。这与张昊等的研究结果一致。耐胆盐的试验结果显示，芽孢杆菌S51对胆盐的耐受性最强，在0.1％的胆盐浓度下存活率可达50％以上。这些结果表明地衣芽孢杆菌S51对酸和胆盐的耐受性强于另外2株菌，有作为益生菌添加剂的潜力。

本研究从土壤及鸡的肠道和肛拭子样本中分离出20株对AFB1具有降解作用的芽孢杆菌，其中有4株地衣芽孢杆菌对AFB1的降解率在50％以上。从中筛选出一株对AFB1降解率较高的地衣芽孢杆菌S51，其具有良好的生长性能，无溶血现象，耐酸、耐胆盐，耐药性较差，有望作为微生物添加剂用于降低饲料中AFB1的含量。后续仍需开展动物体内试验检测S51在动物体内的安全性和解毒效果。