玉米苗枯病病原鉴定及其对戊唑醇的敏感性

摘要：为明确玉米苗枯病病原菌的种类、致病性及其对戊唑醇的敏感性，本研究以2021年采自山东省淄博市的玉米苗枯病植株为对象，对其进行病原菌分离、鉴定、致病性及对戊唑醇敏感性的测定。结果表明，从玉米苗枯病病株根部共分离到16株菌，经形态观察、序列比对及系统发育分析，鉴定出7株尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、4株F.incamatum-equiseti复合种、2株假禾谷镰刀菌（F.pseudograminearum）、2株腐皮镰刀菌（F.solani）和1株三线镰刀菌（F.tricinctum）。致病性测定发现，尖孢镰刀菌、F.incamatum-equiseti复合种和假禾谷镰刀菌均能引起玉米幼苗根部发病。对戊唑醇敏感性测定结果表明，16株菌株的EC50值最低为0.03 ug/mL，最高为3.18 ug/mL，有2株菌的EC50值高于0.30 ug/mL。综上，山东省淄博市玉米苗枯病的优势病原菌为尖孢镰刀菌和F.incamatum-equiseti复合种。同时，本研究检测到对戊唑醇敏感性降低的菌株，建议使用与戊唑醇复配的杀菌剂用于防治玉米苗枯病以延长戊唑醇的使用时间。

关键词：玉米苗枯病；植物病原真菌；镰刀菌；致病性；戊唑醇

中图分类号：S435.131 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2024）12-0092-06

玉米苗枯病是玉米苗期重要的病害之一，制约着玉米的高产。玉米苗枯病在我国各玉米种植区均有发生，严重地块发病率高达80％，严重影响产量。玉米苗枯病在玉米2～3叶期开始表现症状，病株根系发育不良，主根腐烂呈褐色，侧根减少，根部吸水能力下降，进而导致基部的叶片逐渐干枯，严重时整株枯萎并死亡。玉米苗期温度、湿度和土壤肥力都影响该病害的发生。玉米苗枯病是由多种病原真菌复合侵染引起的，病原菌种类很多，在我国主要由禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）和串珠镰刀菌（F.moniliforme）等镰刀菌侵染引起，另外，腐霉菌（Pythium spp.）和丝核菌（Rhizoctonia spp.）也可引起该病害。2022年，Jiang等首次在我国报道了由假禾谷镰刀菌（F.pseudograminearum）引起的玉米苗枯病。玉米苗枯病主要通过土壤和种子传播。

当前预防玉米苗枯病的有效方法是种子包衣。戊唑醇是一种三唑类内吸型杀菌剂，通过影响麦角甾醇的生物合成抑制植物病原真菌的生长。随着戊唑醇的大面积使用，目前，已在自然界中分离到对戊唑醇有抗性的禾谷镰刀菌和葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea），其抗药性主要是由基因CYP51突变引起的。研究发现，禾谷镰刀菌基因FgCYP51B的突变减弱了戊唑醇与FgCyp51B蛋白之间的亲和力，进而导致其对戊唑醇的敏感性降低。

山东省玉米种植面积约占全国的1/10（https：//data.stats.gov.cn/）。有关山东省玉米苗枯病的报道只有1993年的泰安市和1998-2002年的聊城市。山东省作为我国玉米的主产区，近二十年来，缺乏玉米苗枯病相关的研究。不同地区引起玉米苗枯病的病原菌种类存在差异，随着近年来发病加重，有必要对其进一步加以鉴定。此外，戊唑醇广泛应用于小麦和玉米，玉米苗枯病病原菌对戊唑醇的敏感性目前尚不清楚。2021年山东省淄博市高青县玉米苗枯病发生严重，本研究对该地区的玉米苗枯病病株进行病原分离鉴定，同时测定分离菌株对戊唑醇的敏感性，旨在明确玉米苗枯病的病原菌种类、致病性及对戊唑醇的敏感性，进而为玉米苗枯病的田间防治及致病菌抗药性研究提供理论依据。

1材料与方法

1.1试验材料

2021年7月，在山东省淄博市高青县两块玉米苗枯病发生严重的田块采集具有典型玉米苗枯病症状的病株，带回实验室分离发病组织的病原菌。致病性测定所用的玉米品种为郑单958。戊唑醇（有效成分浓度为97％，品牌为阿拉丁）原药用丙酮配制成浓度为5 mg/mL的母液，置于4℃冰箱保存备用。

1.2试验方法

1.2.1发病植株根部真菌的分离 取发病玉米植株根部，用自来水清洗干净，用剪刀将病健交界处的根组织剪成小块，依次置于75％酒精中消毒30 s、3％次氯酸钠溶液中消毒90 s，然后用无菌蒸馏水清洗3次：之后用无菌滤纸将消毒后的病组织表面的水吸干，放置于PDA培养基中，置于25℃的培养箱中培养；3 d后，用无菌牙签将长出的菌落转移至新的PDA培养基中，进行单孢分离纯化并保存于PDA斜面。

1.2.2真菌鉴定 活化分离的真菌3d后，用直径5 mm打孔器在菌落边缘打取菌饼，将菌饼接至PDA培养基中央，4d后，观察菌落形态并拍照。用牙签刮取所有菌株PDA培养基中的菌丝，利用CTAB法提取菌丝的基因组DNA；用引物EF1/EF2（表1）对所有菌株的TEF-1a序列进行PCR扩增，EasyTaq DNA聚合酶购自北京全式金生物技术股份有限公司。反应体系：ddH2O18.2 uL，EasyTaq Buffer 2.5 uL，dNTP 2 uL，上、下游引物各0.5 uL，EasyTaq DNA Polymerase 0.3uL，DNA模板1 uL。反应程序：95℃ 3min；95℃30 s，54℃40 s，72℃30 s，35个循环；72℃10 min。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后，送至北京六合华大基因科技有限公司测序，测序结果在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.ruh.gov/）中比对分析。

1.2.3分离菌株致病性测定 取适量玉米种子（郑单958），置于3％次氯酸钠溶液中表面消毒3min，用无菌水清洗3次。在无菌培养皿中铺三层无菌滤纸，将消毒后的玉米种子放入其中，加适量无菌水（滤纸湿润，无明显流动水），置于25℃的培养箱中催芽。3d后，在上述分离纯化培养的菌落边缘打取菌饼，用两层无菌纱布将菌饼和玉米根缠在一起，放在铺有三层无菌滤纸的培养皿中，每个菌株重复3次，置于25℃培养箱中培养（12 h光照/12 h黑暗），7d后观察玉米苗发病情况并拍照。

1.2.4分离菌株对戊唑醇的敏感性测定 以5mg/mL的戊唑醇为母液，用丙酮分别稀释至1.0、0.5、0.25、0.125、0.062 5 mg/mL共5个浓度，分别加入PDA培养基中，使戊唑醇终浓度分别为1、0.5、0.25、0.125、0.062 5 ug／mL。所有PDA培养基（包括不加戊唑醇的PDA培养基）中，丙酮浓度均为1 uL/mL。活化分离的真菌3d后，在菌落边缘打取菌饼，放置于含有不同浓度戊唑醇的PDA培养基中央，每个菌株重复3次，置于25℃培养箱中培养3d后，采用十字交叉法测量菌落直径。抑制率（％）=（对照菌落直径-处理菌落直径）／对照菌落直径×100。戊唑醇对每株真菌的EC50值（半最大效应浓度）用软件DPS 19.05计算。显著性检验用SPSS 22.0软件中的Duncan's法进行分析。

2结果与分析

2.1玉米苗枯病发病植株根部真菌分离

对山东省淄博市高青县玉米苗枯病病株的根部进行病原菌分离，共得到16株真菌。根据菌落形态特征观察（图1），初步鉴定为镰刀菌属真菌。其中，菌株SIAI413气生菌丝呈灰白色，稀疏：菌株SAIA41C气生菌丝旺盛，呈白色到黄色，产生粉色到红色色素：菌株SAIA41F气生菌丝呈白色，致密；菌株SAIA41H气生菌丝呈白色到粉色，产生红色到深红色色素；菌株SAIA41N气生菌丝呈白色，致密。

2.2分离真菌的鉴定

对分离到的16株真菌TEF-1a序列进行PCR扩增并测序，通过在NCBI数据库比对分析，发现菌株SAIA411、SAIA417、SAIA41A、SAIA41E、SAIA41J、SAIA41N和SAIA41P的序列与尖孢镰刀菌（F.oxysporum）的相似性最高；菌株SAIA413、SAIA41D、SAIA41F和SAIA41Q的序列与F.icarnatum-equiseti复合种的相似性最高；菌株SAIA41B和SAIA41C的序列与假禾谷镰刀菌（F.pseudograminearum）的相似性最高；菌株SAIA419和SAIA41G的序列与腐皮镰刀菌（F.solani）的相似性最高；菌株SAIA41H的序列与三线镰刀菌（F.tricincturn）的相似性最高。

通过构建系统发育树，将菌株SAIA411、SAIA417、SAIA41A、SAIA41E、SAIA41J、SAIA41N和SAIA41P鉴定为尖孢镰刀菌：菌株SAIA413、SAIA41D、SAIA41F和SAIA41Q鉴定为F.incamatum-equiseti复合种；菌株SAIA41B和SAIA41C鉴定为假禾谷镰刀菌：菌株SAIA419和SAIA41G鉴定为腐皮镰刀菌：菌株SAIA41H鉴定为三线镰刀菌（表2，图2）。其中，尖孢镰刀菌所占的比例最高，为43.75％，F.incamoturn-equiseti复合种次之，为25.00％。

2.3分离菌株的致病性

为明确分离菌株对玉米的致病性，根据菌株鉴定结果和菌落生长速度，我们选取菌株SAIA413、SAIA41C、SAIA41F和SAIA41N，测定其在玉米上的致病性。结果（图3）表明，这4株菌株都能够引起玉米苗期根部发病，造成根部变褐、腐烂以及发育不良。其中，菌株SAIA41C的致病力最强，造成玉米根部严重发育不良，几乎丧失了所有须根。对发病根部进行病原菌分离，均得到相对应的接种菌，验证了科赫氏法则。因此，尖孢镰刀菌、F.inarnaturn-equiseti复合种和假禾谷镰刀菌都能够引起玉米苗枯病。

2.4分离菌株对戊唑醇的敏感性

分离菌株对戊唑醇的敏感性测定结果（表2）表明，16株真菌的EC50值为0.03-3.18 ug/mL，平均EC50值为0.36 ug/mL。其中，三线镰刀菌的EC50值最高，假禾谷镰刀菌的EC50值次之，F.incarnatum-equiseti复合种的EC50值最低（图4）。假禾谷镰刀菌与尖孢镰刀菌和F.incamatum-eq-mseti复合种的EC50值之间存在显著性差异；腐皮镰刀菌与F.incamatum-equiseti复合种的EC50值之间也存在显著性差异。

3讨论与结论

玉米苗枯病主要是由镰刀菌属真菌复合侵染引起的。前期研究发现，在我国浙江省东阳市和天台县、山西省昔阳县以及河西走廊地区，玉米苗枯病的主要病原为串珠镰刀菌。在山东省泰安市以及东北地区，引起玉米苗枯病的病原主要是串珠镰刀菌和禾谷镰刀菌。本研究中，引起玉米苗枯病的病原菌主要是尖孢镰刀菌，这与以往报道不同。这可能有以下几点原因：一是地理位置不同，此次分离的地点在山东省淄博市，之前未见报道；二是随着时间的变化，优势病原菌可能也在变化，已报道的玉米苗枯病病原的研究大多是十年之前的：另外，气候改变以及病原菌的不断进化也都有可能造成优势病原菌的改变。

在防治病害的措施中，化学防治持效期长、便于操作、效果稳定且成本较低，是最有效的手段。但由于化学农药的大量使用，导致田间出现了耐药性和抗药性菌株，因此，将杀菌机理不同、无交互抗性的杀菌剂复配使用，避免连续多年使用同一种杀菌剂，可以延缓病原菌产生抗药性。目前，在自然环境中已经发现了具有戊唑醇抗性的禾谷镰刀菌和亚洲镰刀菌。另外，在F.incamatum-equiseti复合种中也检测到对戊唑醇敏感性降低的菌株，但该抗性并非由基因CYP51C突变引起。本研究发现，大部分菌株对戊唑醇的EC50值在0.30 ug/mL以下，但其中一株三线镰刀菌的EC50值为3.18 ug/mL。由于本研究菌株数量较少，后续研究需测定更多三线镰刀菌对戊唑醇的敏感性，进而判断是否所有的三线镰刀菌对戊唑醇产生了抗药性。