趋化因子CCL19 诱导巨噬细胞M1 极化对小鼠慢性胰腺炎的促进作用及其机制

［摘 要］ 目的：探讨趋化因子C-C基序配体19（CCL19） 诱导巨噬细胞M1极化对小鼠慢性胰腺炎的促进作用，并阐明其相关机制。方法：选取10只雄性C57BL/6N小鼠，提取小鼠胰腺腺泡细胞和腹腔巨噬细胞，构建巨噬细胞-腺泡细胞共培养体系，共培养体系细胞分为对照组、模型组和小干扰RNA CCL19 （si-CCL19） 组，显微镜下观察各组腺泡细胞形态表现。随机选取40 只小鼠，分为正常组和慢性胰腺炎组，每组20 只。HE 染色观察2 组小鼠胰腺组织病理形态表现，免疫荧光染色法观察2 组小鼠胰腺组织中角质蛋白19 （CK19）、淀粉酶、M1 型巨噬细胞相关标志物诱导型一氧化氮合酶（iNOS） 和F4/80 表达情况及各组共培养体系细胞中腺泡细胞形态表现及CK19 和淀粉酶表达情况，酶联免疫吸附试验（ELISA） 法检测2 组小鼠血清和各组共培养体系细胞中肿瘤坏死因子α （TNF-α）、白细胞介素（IL）-6 和IL-1β 水平， 免疫组织化学法观察2 组小鼠胰腺组织中CCL19 蛋白表达情况，Western blotting 法检测2 组小鼠胰腺组织和各组共培养体系细胞中CCL19 蛋白和关键蛋白核因子κB（NF- κB） 信号通路相关蛋白P65、磷酸化P65 （p-P65）、κB 抑制物激酶α/β （IKKα/β）、磷酸化IKKα/β（p-IKKα/β）、IκBα和磷酸化IκBα（p-IκBα） 表达水平。结果：HE染色，正常组小鼠胰腺组织腺泡细胞的紧密排列；与正常组比较，慢性胰腺炎组小鼠胰腺组织腺泡细胞产生了明显的空泡化，即腺泡细胞导管化，小鼠胰腺炎模型制备成功。免疫荧光染色法，与对照组比较，模型组腺泡细胞严重的空泡化明显，CK19 表达明显增加，淀粉酶表达明显减少；与模型组比较，si-CCL19 组中腺泡细胞导管化程度降低，CK19 表达明显减少，淀粉酶表达明显增加；与正常组比较，慢性胰腺炎组小鼠胰腺组织中淀粉酶表达明显减少， CK19 和M1 型巨噬细胞标志物iNOS 及F4/80 表达均明显增加。ELISA 法， 与正常组比较， 慢性胰腺炎组小鼠血清中TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平均明显升高（Plt;0. 05）；与对照组比较，模型组细胞中TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平均明显升高（Plt;0. 05）；与模型组比较，si-CCL19 组细胞中TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平均明显降低（Plt;0. 05）。免疫组织化学法，与正常组比较，慢性胰腺炎组小鼠胰腺组织中CCL19 蛋白表达明显增加。Western blotting 法，与正常组比较，慢性胰腺炎组小鼠胰腺组织中CCL19 蛋白表达水平和NF-κB 信号通路相关蛋白p-IKKα/β、p-P65及p-IκBα 蛋白表达水平均明显升高（Plt;0. 05）。与对照组比较，模型组细胞中CCL19、p-IKKα/β、p-P65和p-IκBα 蛋白表达水平均明显升高（Plt;0. 05）；与模型组比较，si-CCL19 组细胞中CCL19、p-IKKα/β、p-P65和p-IκBα蛋白表达水平均明显降低 （Plt;0. 05）。结论：CCL19通过NF-κB信号通路促进巨噬细胞M1 型极化，诱导炎症微环境的产生，促进胰腺炎的发生发展。

［关键词］ 胰腺炎； C-C 基序配体19； 巨噬细胞； M1 型极化； 核因子κB

［中图分类号］ R364. 5 ［文献标志码］ A

胰腺是体内仅次于肝脏的第二大腺体，由内分泌部和外分泌部组成，外分泌部主要由腺泡细胞和导管细胞构成。腺泡细胞可以产生和释放大量消化酶，包括淀粉酶和脂肪酶等，这些消化酶经过胰腺导管输送至十二指肠，对机体消化过程发挥重要作用。在胰腺炎过程中，一部分胰腺腺泡细胞发生形态学改变，转变为管状结构，成为导管细胞，不再表达腺泡细胞标记物，但在治疗后胰腺导管细胞同样具有向腺泡细胞转化的潜能［1］。慢性胰腺炎是由多种病因导致的，胰酶在胰腺内被过度激活后引起胰腺组织自身消化、水肿、出血甚至坏死的炎症反应［2］。

免疫微环境是炎症微环境的重要组成部分，免疫微环境的改变是导致炎症产生的主要因素，其中巨噬细胞是免疫微环境的重要组成部分［3］。研究［4］显示：巨噬细胞的M1 型极化会通过分泌白细胞介素（interleukin， IL）-1β、IL-6 和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α） 等炎症因子促进炎症的产生。核因子κB （nuclear factor-kappa B，NF-κB） 信号通路，即NF- κB/κB 抑制物激酶α/β（inhibitor of κB kinase-α/β， IKKα/β） /磷酸化IKKα/β（phosphorylated IKKα/β， p-IKKα/β） /P65/磷酸化P65 （phosphorylated P65， p-P65） /IκBα/磷酸化IκBα （phosphorylated IκBα， p-IκBα）， 其调控巨噬细胞炎症反应，是巨噬细胞M1 型极化的重要信号通路［5］。C-C基序配体19（C-C motif ligand 19，CCL19）是CC 类趋化因子家族成员，又称为巨噬细胞炎性蛋白3β，是内环境稳定性趋化因子。其主要由中性粒细胞、淋巴内皮细胞和淋巴结Ｔ淋巴细胞释放，趋化幼稚T 淋巴细胞和成熟树突细胞（dendriticcells，DC）［6］。CCL19 在慢性胰腺炎中对免疫微环境具体的调控机制尚未完全阐明。因此，本研究探讨CCL19 对NF-κB 信号通路的调节作用，阐明其诱导巨噬细胞M1 型极化促进胰腺炎发生的作用机制，为慢性胰腺炎的临床治疗提供参考。

1 材料与方法

1. 1 实验动物、主要试剂和仪器 雄性C57BL/6N小鼠50 只，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK （辽） 2020-0001。RPMI-1640 培养基、Waymouth 培养基、胎牛血清和RIPA 缓冲液购自北京Biosharp 公司， NewSuper ECL 检测试剂盒购自北京百欧泰生物科技有限公司，兔抗CCL19 多克隆抗体、兔抗p-IKKα/β多克隆抗体、兔抗IKKα/β 多克隆抗体、兔抗p-P65多克隆抗体、兔抗P65 多克隆抗体、兔抗p-IκBα 多克隆抗体、兔抗CCL19 多克隆抗体和兔抗GAPDH多克隆抗体购自英国Abcam 公司， 小干扰RNACCL19 （small interfering RNA CCL19，si-CCL19）购自广东省广州锐博生物有限公司， 即用型HRP标记的羊抗兔二抗购自北京欣博盛生物科技有限公司，TNF-α、IL-6 和IL-1β 细胞因子酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）检测试剂盒购自广东省深圳康肽生物科技有限公司，荧光标记DAPI 购自北京索莱宝科技有限公司，IκBα一抗、 免疫荧光兔抗角质蛋白19（ cytokeratin 19，CK19） 多克隆抗体、兔抗Amylase 多克隆抗体、兔抗F4/80 多克隆抗体、兔抗诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS） 多克隆抗体、Alexa Fluo488 山羊抗兔二抗和Rhodamine 山羊抗兔二抗购自美国Proteintech 公司，免疫组织化学试剂购自青岛海氏海诺医疗科技有限公司，其他生化试剂均为进口分装或国产分析纯。低温高速离心机和-80°C 冰箱购自美国Thermo 公司，酶标仪购自美国Bio-Tek 公司，倒置相差显微镜和倒置荧光显微镜购自日本Olympus 公司，电泳仪购自北京六一有限公司。

1. 2 小鼠胰腺腺泡细胞和腹腔巨噬细胞提取 提取胰腺腺泡细胞： 胰蛋白酶抑制剂加入1% 青-链霉素双抗和血清培养基混匀，磷酸二氢钾溶液、丙酮酸钠和1% 青-链霉素双抗消化液备用。取5 只小鼠，脱臼处死，置于75% 乙醇溶液浸泡，立即切取小鼠胰腺组织，磷酸盐缓冲液（phosphate bufferedsaline，PBS） 洗涤2 次，置于消化液中剪碎消化20 min。吸取上清液至离心管中， 皿中加入消化液，二次消化。吸出所有消化液，加入含大豆酶抑制剂的Waymouth 培养基终止消化， 1 720 r·min－1离心2 min， 弃上清液， 加入培养基， 重复离心1 次，弃上清。乙酸溶液中里加入鼠尾胶原后，加入到培养皿中，冲洗内壁。紫外照射放置1 h，PBS 缓冲液冲洗2 次，获得胰腺腺泡细胞，吸取培养液并加入新的培养基培养。提取腹腔巨噬细胞： 取5 只小鼠， 脱臼处死，置于75% 乙醇溶液中浸泡， 切开小鼠腹腔， 后用镊子夹起腹膜， 吸取冷PBS 和酶缓冲液注入至腹腔中灌洗，手指揉小鼠腹部，用镊子夹起腹膜再用针管吸出灌洗液，灌洗液中含有的巨噬细胞即为被采集的腹腔巨噬细胞。

1. 3 小鼠胰腺腺泡细胞与巨噬细胞共培养体系制备和分组 采用巨噬细胞-腺泡细胞共培养体系，Transwell 小室培养， 下室为巨噬细胞， 上室为腺泡细胞。共培养体系分为对照组、模型组和si-CCL19 组， 对照组下室的巨噬细胞为未极化的原代巨噬细胞，模型组下室的巨噬细胞为40 μg·L－1γ 干扰素（interferon-γ，IFN-γ） 和400 μg·L－1 脂多糖（lipopolysaccharide， LPS） 诱导的与炎症发展密切相关的M1 型巨噬细胞， si-CCL19 组下室为M1 型巨噬细胞并转染si-CCL19，3 组培养体系的上室均为提取的原代腺泡细胞［7］。按照参考文献［8］中方法培养腺泡细胞。共培养体系中的细胞制备结束后，加入RPMI-1640 培养基，孵育18 h，显微镜观察腺泡细胞形态表现。

1. 4 小鼠胰腺炎模型制备 选取 40 只体质量为20～22 g 的C57BL/6N 小鼠， 分为正常组和慢性胰腺炎组， 每组20 只。慢性胰腺炎组小鼠腹腔注射雨蛙素50 μg·kg－1 诱导小鼠胰腺炎模型，每周给药3 d，每日6 次，每次间隔1 h；正常组小鼠注射同等次数和剂量的生理盐水，至第4 周造模结束，处死小鼠后解剖，取出小鼠胰腺组织［9］。显微镜下观察胰腺炎模型小鼠胰腺组织导管化情况和CK19和淀粉酶表达情况，判定小鼠胰腺炎模型制备情况。

1. 5 HE 染色观察 2组小鼠胰腺组织病理形态表现 小鼠胰腺组织石蜡切片脱蜡后， 苏木素染色3～8 min，自来水冲洗，于1% 盐酸乙醇溶液分化数秒， 自来水冲洗， 0. 6% 氨水返蓝， 流水冲洗，伊红染色1～3 min。切片脱水，中性树胶封片，显微镜观察2 组小鼠胰腺组织病理形态表现。

1. 6 免疫荧光染色法观察 2 组小鼠胰腺组织中CK19、淀粉酶、iNOS和F4/80表达情况及各组共培养体系细胞中腺泡细胞形态表现及CK19和淀粉酶表达情况 小鼠胰腺组织石蜡切片脱蜡后进行抗原修复，置于抗原修复液体中，放入微波炉，中火处理30 min。冷却至室温后，回收抗原修复液。加入3% 过氧化氢溶液浸泡10 min， 冲洗。5% 山羊抗兔血清封闭， 水洗。加入兔抗CK19 一抗、兔抗Amylase 一抗、兔抗F4/80 一抗和兔抗iNOS 一抗，室温孵育2 h。回收一抗， PBS 缓冲液洗涤3 次。孵育山羊抗兔二抗，置于室温避光1 h，回收二抗，使用PBS 缓冲液冲洗。DAPI 染色5 min 后冲洗，显微镜观察2 组小鼠胰腺组织中CK19、淀粉酶、iNOS 和F4/80 免疫荧光强度及各组共培养体系细胞中腺泡细胞形态表现及CK19 和淀粉酶免疫荧光强度。

1. 7 ELISA法检测 2组小鼠血清和各组共培养体系细胞中TNF-α、IL-6和IL-1β水平 取2组小鼠血清，根据试剂盒说明书操作，检测2 组样本中炎症因子TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平。酶标仪检测波长450 nm 处各样本吸光度（A） 值，绘制标准曲线，计算2 组小鼠血清和各组共培养体系细胞中TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平。

1. 8 免疫组织化学法观察 2 组小鼠胰腺组织中CCL19 蛋白表达情况 小鼠胰腺组织石蜡切片脱蜡后抗原修复， 血清封闭， 水洗。加入兔抗CCL19 一抗孵育1. 5 h。PBS 缓冲液洗涤3 次， 孵育山羊抗兔二抗，置于室温30 min，苏木素染色。将复染后切片置于水中， 冲洗后脱水， 中性树胶封片。显微镜观察2 组小鼠胰腺组织中CCL19 蛋白表达情况。

1. 9 Western blotting 法检测 2 组小鼠胰腺组织和各组共培养体系细胞中CCL19蛋白及NF-κB信号通路相关蛋白表达水平 将巨噬细胞和小鼠胰腺组织于RIPA 缓冲液中裂解，细胞置于冰上快速充分研磨1 min，胰腺组织于液氮中取出后，置于破碎机研磨充分破碎。冰上放置15 min。置于4 ℃、11 000 r·min－1 离心15 min， 吸上清于新的离心管中。加入含β-巯基乙醇的上样缓冲液； 置于95 ℃的金属浴模块中加热变性10 min。制备10%SDS-PAGE 浓缩胶和分离胶进行电泳操作。使用聚偏二氟乙烯膜于300 mA 电流条件下进行转膜。TBST 溶液洗膜，脱脂牛奶封闭，兔抗CCL19 一抗（1∶ 1 000）、兔抗p-IKKα/β 一抗（1∶ 1 000）、兔抗IKKα/β 一抗（1∶ 1 000）、兔抗p-P65 一抗（1∶1 000）、兔抗P65 一抗（1∶1 000）、兔抗p-IκBα一抗（1∶ 1 000）、兔抗GAPDH 一抗（1∶ 1 000）和兔抗IκBα 一抗（1∶ 1 000）， 室温孵育2 h 后回收， 再用TBST 溶液清洗3 次， 加入即用型HRP标记的羊抗兔二抗。孵育1h 后回收清洗。配制显影液，均匀洒在PVDF 膜上，将膜置于显影仪中显影， 采用Image J 软件分析蛋白条带灰度值， 以GAPDH 为内参，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/内参蛋白条带灰度值。

1. 10 统计学分析 采用GraphPad Prism 7. 0 统计软件进行统计学分析。2 组小鼠血清和各组共培养体系细胞中TNF-α、IL-6 及IL-1β 水平，CCL19 蛋白和NF-κB 信号通路相关蛋白表达水平均符合正态分布，以x±s 表示。2 组间样本均数比较采用两独立样本t 检验。以Plt;0. 05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2. 1 2组小鼠胰腺组织病理形态表现 正常组小鼠胰腺组织腺泡细胞紧密排列。与正常组比较，慢性胰腺炎组小鼠胰腺组织腺泡细胞产生了明显的空泡化，即腺泡细胞导管化，小鼠胰腺炎模型制备成功。见图1。

2. 2 各组 M1极化巨噬细胞-腺泡细胞共培养体系中腺泡细胞形态表现和细胞中 CK19 和淀粉酶表达情况 荧光显微镜下，绿色荧光强度代表CK19的表达，红色荧光强度代表淀粉酶的表达。与对照组比较， 模型组腺泡细胞严重的空泡化明显，CK19 表达明显增加，淀粉酶表达明显减少。与模型组比较， si-CCL19 组中腺泡细胞导管化程度降低， CK19 表达明显减少， 淀粉酶表达明显增加。见图2～5。

2. 3 2组小鼠胰腺组织中 CK19、淀粉酶、iNOS和F4/80表达情况 与正常组比较，慢性胰腺炎组小鼠胰腺组织中淀粉酶表达明显减少，CK19 和M1 型巨噬细胞标志物iNOS 及F4/80 表达均明显增加。见图6 和7。

2. 4 2 组 小 鼠 血 清 和 各 组 共 培 养 体 系 细 胞 中TNF-α、IL-6及 IL-1β水平 与正常组比较，慢性胰腺炎组小鼠血清中TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平均明显升高（Plt;0. 05）。与对照组比较，模型组细胞中TNF- α、IL-6 和IL-1β 水平均明显升高（Plt;0. 05）。与模型组比较，si-CCL19 组细胞中炎症因子TNF- α、IL-6 和IL-1β 水平均明显降低（Plt;0. 05）。见图8～9。

2. 5 2 组小鼠胰腺组织中 CCL19 蛋白表达情况 与正常组比较， 慢性胰腺炎组小鼠胰腺组织中CCL19 蛋白表达明显增加。见图10。

2. 6 2组小鼠胰腺组织和各组共培养体系细胞中CCL19蛋白及 NF-κB信号通路相关蛋白表达水平 与正常组比较， 慢性胰腺炎组小鼠胰腺组织中CCL19、p-IKKα/β、p-P65 和p-IκBα 蛋白表达水平均明显升高（Plt;0. 05）。与对照组比较， 模型组细胞中CCL19、p-IKKα/β、p-P65 和p-IκBα 蛋白表达水平均明显升高（Plt;0. 05）。与模型组比较，si-CCL19 组细胞中CCL19、p-IKKα/β、p-P65 和p-I κ B α 蛋白表达水平均明显降低（Plt;0. 05）。图11～13。

3 讨 论

慢性胰腺炎是一种胰腺进行性炎症， 病发后会伴随出现腹痛及内、外分泌失调等症状［10］。长期的慢性胰腺炎是诱发胰腺癌的主要诱因之一，因此治疗慢性胰腺炎对预防胰腺癌的发生具有重要意义［11-12］。慢性胰腺炎患者胰腺腺泡细胞导管化的过程可以通过多种机制发生， 包括细胞类型的选择性增殖或丢失及祖细胞的分化或转分化［13-14］。胰腺炎患者胰腺组织中CK19 表达增加，淀粉酶表达减少［10］。本研究结果显示： 胰腺炎小鼠胰腺组织中M1 型巨噬细胞数量增加， CCL19蛋白及NF- κB 信号通路相关蛋白表达水平升高，提示CCL19 可能与小鼠慢性胰腺炎中M1 型巨噬细胞NF- κB 信号通路有密切关联。敲低CCL19后，NF-κB 信号通路相关蛋白表达水平明显降低，且si-CCL19 组腺泡细胞导管化程度降低， 提示抑制CCL19 蛋白表达可以抑制NF- κ B 信号通路， 进而抑制巨噬细胞M1 型极化，抑制慢性胰腺炎的产生。

在慢性胰腺炎中，免疫微环境的改变是导致慢性胰腺炎发生发展的重要因素［15］。巨噬细胞是胰腺炎中丰富的免疫细胞群体，且具有高度异质性，可以响应微环境发生表型转化， 包括经典激活巨噬细胞（M1 型） 和交替激活巨噬细胞（M2 型）［16］。M1 型巨噬细胞具有促炎作用， 会在炎症部位富集并产生多种促炎细胞因子， 如IL-1β、IL-6 和TNF-α 等［17-18］。CK19 和淀粉酶表达情况为评价慢性胰腺炎的重要指标，而iNOS 和F4/80 表达情况是评价M1 巨噬细胞的指标。本研究结果显示：M1 型巨噬细胞-腺泡细胞共培养体系中，模型组腺泡细胞出现了明显的空泡化，即腺泡细胞导管化，且CK19 表达增加， 淀粉酶表达减少， 证实M1 型极化的巨噬细胞诱导腺泡细胞导管化，进而导致胰腺炎的产生。

CCL19 是CC 类趋化因子家族成员，是内环境稳定性趋化因子［19］。CCL19 与免疫微环境有密切关联，同时还可以通过调控免疫微环境对多种炎症具有促进作用［20］。例如，CCL19 可以通过趋化巨噬细胞加重小鼠结肠炎，通过招募中性粒细胞加重LPS 诱导的急性肺部炎症， 也可通过抑制中性粒细胞的积累抑制皮肤炎症的发生［21-23］。本研究成功构建小鼠胰腺炎模型，胰腺炎小鼠胰腺组织中CCL19 蛋白表达水平明显升高， 并伴有巨噬细胞浸润增加。在脂多糖处理的肝细胞中，多功能干细胞与转录激活因子相互作用激活了CCL19 的转录，CCL19 反作用于巨噬细胞， 促进了其在肝脏中的积累［24］。本研究结果显示：CCL19 可以通过促进NF-κB 信号通路相关蛋白表达， 进而对巨噬细胞M1 型极化发挥促进作用，诱导小鼠慢性胰腺炎的发生发展， 提示CCL19 在炎症中是一个重要的免疫微环境调控靶点， 可以通过干预CCL19 对炎症过程中的免疫微环境起调控作用， 从而达到治疗目的。

综上所述， CCL19 通过NF-κB 信号通路促进巨噬细胞M1 型极化，诱导炎症微环境的产生，从而促进胰腺炎的发生发展。CCL19 可以作为治疗慢性胰腺炎的靶点，本研究为后续胰腺炎相关疾病的临床治疗提供了新的思路。

利益冲突声明：所有作者声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：崔连鸷参与实验设计、细胞实验和论文撰写，张晓伟参与细胞实验和实验数据整理，翟悦和潘悦参与动物实验，于秀艳参与实验设计和数据整理。

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