不同地点条件下玉米单倍体自然加倍及除草剂加倍效率

摘要：本研究探究了4个不同基础材料单倍体在不同地点的自然加倍率，以及经过不同除草剂处理下的单倍体加倍效果之间的差异。结果表明，海南试验点的自然加倍率要明显高于吉林试验点的自然加倍率，说明海南的气候和光照等适宜的环境条件更有利于玉米单倍体的自然加倍，且不同品种的单倍体自然加倍率有很大差异，说明不同基础材料由于遗传背景的差异对加倍效果产生不同影响；化学除草剂加倍处理下，浓度为80 μmol·L-1炔苯酰草胺及60 μmol·L-1安磺灵的加倍效果最好，而高浓度安磺灵的加倍率明显低于炔苯酰草胺；同为80 μmol·L-1炔苯酰草胺处理下的针刺生长点法的加倍率稍高于浸芽法的加倍率。

关键词：玉米 单倍体 自然加倍 除草剂加倍玉米作为我国不可或缺的粮食作物，其新品种选育的迫切性有目共睹，然而常规的育种技术育种周期普遍较长，通常需要经过6-10代的自交才能选育出优良的新品种[1]。单倍体育种技术在很大程度上规避了常规育种耗时长、消费高的弊端，做到高效又节省成本，通过两代的培育就可以得到纯合的自交系，并且该技术还能够选育出具有植株高大、花期长、花粉量大、抗病虫害等优良性状的新品种[2]。目前我国常规的育种技术已经实现在玉米育种行业的普及，但对玉米单倍体育种技术的研究起步较晚，与国外的发达国家依然存有差距。国外发达国家的某些种子公司已经建立了全面的单倍体育种体系，并能够进行大规模的工厂化育种。但我国的一些育种公司与科研院所还无法达到规模化育种。还存在着由于单倍体加倍率低导致玉米单倍体育种技术发展受阻的问题[3]。为推动单倍体育种技术的发展，突破发达国家的技术封锁，单倍体加倍率低已成为各育种单位和育种家重点研究和攻克的方向。

玉米单倍体育种技术的自然加倍法能够节约育种的成本，减轻对自然环境的危害，加倍环节简单快捷，受到广泛的青睐。玉米单倍体的化学加倍法使用最多的化学药剂是秋水仙素，但秋水仙素具有较高的毒性，容易危害植株的生长发育甚至死亡并且处理程序烦琐，也可能对环境造成污染，影响土壤和水源从而破坏生态环境和生态平衡[4]。为了玉米单倍体育种技术的发展和环境的保护，必须寻找安全的化学试剂，本研究主要使用的除草剂为安磺灵和炔苯酰草胺，这两种除草剂与秋水仙素相似，同样具有使单倍体加倍的效果，但目前对这两种除草剂的研究相对较少。除这两种除草剂之外，甲基胺草磷和氟乐灵也是常用于单倍体加倍的除草剂[5]。根据前人的研究表明，这四种除草剂虽然都具有抑制细胞分裂的效果，但每种除草剂的加倍效果不同，并且不同基础材料诱导出的单倍体对不同除草剂的适应程度也不同[6]。

本研究不仅探索不同除草剂的加倍效果，对化学加倍的方法也进行了一定程度的研究。常用的化学加倍方法有浸芽法、浸根法、针刺生长点法及滴心叶法。本试验采用的化学加倍方法是浸芽法和针刺生长点法。浸芽法是将玉米单倍体的幼芽浸泡在含有药剂的溶液中，以促进其染色体加倍，而针刺生长点法是在单倍体幼苗的生长点处进行针刺处理，并配合使用药剂处理，以实现染色体加倍。这两种的原理与浸根法基本相似，但处理的目标不同，主要受处理时间的影响。滴心叶法是将药剂溶液滴在单倍体玉米的心叶上，操作较为烦琐。又有众多研究表明，本试验在吉林和海南两地进行，分别采用自然加倍法和化学加倍法研究单倍体的加倍率。在化学加倍法中，使用炔苯酰草胺和安磺灵两种除草剂，通过浸芽法和针刺生长点法测定不同除草剂和不同处理方法下的玉米单倍体加倍率，旨在探究更适合单倍体加倍的除草剂和处理方法，从而为培育新品种提供更有利的试验条件，并为玉米单倍体育种提供理论依据。

一、材料与方法

（一）试验材料

本试验将4个单倍体品种的籽粒作为试验材料进行玉米单倍体加倍试验，分别是九单525、九单918、九单186和九单200。以上4个基础材料为母本，吉科诱115为父本，在前一季玉米种植前进行单倍体诱导，收获的单倍体籽粒为单倍体材料。由于本研究采用自然加倍法、浸芽法以及针刺生长点法三种试验方法，所以将四种单倍体种子分为三组进行研究，分配种子时要进行随机挑选，平均每组1000粒，以确保实验的准确性和严谨性。而用于自然加倍的单倍体籽粒分为两部分种植，一部分位于吉林省吉林市吉林农业科技学院吉林玉米育种试验地（吉林试验点）种植，另一部分位于海南省三亚市崖州区南滨农场的南繁基地试验地（海南试验点）进行种植。采用安磺灵和炔苯酰草胺两种除草剂，使用浸芽法和针刺生长点法进行的除草剂加倍试验均在吉林试验点进行。安磺灵和炔苯酰草胺购自于长春百金生物科技有限公司。

（二）单倍体鉴定

使用籽粒Navajo标记鉴定，紫顶白胚的为单倍体籽粒。该方法是使用具有遗传标记基因的诱导系进行单倍体诱导，将诱导系与基础材料进行杂交，在单倍体籽粒中导入Navajo标记。正常二倍体籽粒为紫顶紫胚。田间苗期鉴定可以通过观察玉米植株的生长情况，初步判断玉米植株是否为单倍体。单倍体的叶鞘为绿色，并且叶片与正常二倍体不同，数量少、宽度狭窄、较为直立，在幼苗生长到4-5叶期时，通过观察植株矮小瘦弱，生长势弱的为单倍体，而正常二倍体幼苗的叶鞘为紫色，植株高大、生长势强。

（三）单倍体加倍

自然加倍：在吉林试验点和海南试验点进行正常田间播种，使植株正常生长，并统一管理，当雄穗有花粉但花药不开裂时人为破坏花药，让花粉散出进行自交授粉。

除草剂加倍：以浓度为2.5%的二甲基亚砜（DMSO）作为助渗剂，将安磺灵、炔苯酰草胺原液制成浓度分别为40、60、80和100 μmol·L-1 的溶液并将试剂瓶放置在阴暗避风处保存待用。以九单525和九单186作为除草剂处理对象。浸芽法：将种子浸泡6h，用毛巾卷发芽法30℃催根，待根尖长至1cm时，从毛巾卷中取出种子，降低温度到24℃，将种子放入搪瓷盘中，喷水保持湿度，用薄膜密封催芽。当幼芽长至1.5cm时，将幼芽顶端芽鞘切掉1-2 mm，露出1个小口。将其在室温下密闭浸泡在药剂溶液中，浸泡后用清水冲洗60min，清洗后将其种在育苗盘中，幼苗长到4-5片叶时移栽至大田。生长期间进行数据调查、记录和收集，秋季收获自交果穗，计算加倍率。针刺生长点法：将上述准单倍体籽粒种植于田间，得到单倍体植株。待单倍体幼苗生长到三叶期时，选择生长良好、一致的幼苗，分别用浓度为40、60、80和100 μmol·L-1 的除草剂+2.5%DMSO混合液1 mL，用微量移液器注射于幼苗茎秆盾片节处的生长点。

（四）统计分析

根据统计自然加倍法和除草剂加倍法中存活单倍体总株数与结实单倍体植株数，计算两种方法的加倍率。加倍率计算公式如下：加倍率=（结实单倍体植株数/存活单倍体总株数）×100%。采用DPS7.1统计软件处理试验数据。

二、结果分析

（一）单倍体自然加倍率分析

4个单倍体材料在两个试验点的加倍效果如表1所示，通过数据比较发现，海南试验点的加倍效果明显好于吉林试验点。九单525与九单186在吉林试验点的加倍率均低于0.5%，而在海南试验点能够达到1%-4%。在4个材料之中，九单525的自然加倍效果最好，在吉林试验点的平均自然加倍加倍率为0.3%，在海南进行自然加倍可以使平均自然加倍率提升至3%。九单186的自然加倍效果次之，在吉林试验点的加倍效果与九单525基本相似，但在海南试验点比九单186的平均加倍率低1.6%，仅仅只有1.4%。而九单918与九单200的加倍效果最差，九单200在两个试验点的加倍率均为0%，说明九单200不适合进行自然加倍。九单918虽然在吉林试验点的加倍率为零，但在海南的加倍率能够达到0.6%，说明优良的气候环境更有利于自然加倍。结果显示，在不同的地点玉米单倍体植株加倍率出现明显差异，导致加倍率出现明显差异的原因可能是不同地点的气候和光照等自然环境条件影响玉米单倍体的自然加倍，吉林试验点昼夜温差较小的逆境生态条件不利于单倍体雄穗加倍。

（二）不同基础材料的自然加倍率

由表1可知，进行试验的4个单倍体材料通过2年自然加倍得到的自然加倍率以九单525（1.65%）最高，九单186（1.8%）较高，九单918（0.3%）次之，九单200单倍体无论是在吉林试验点还是在海南试验点的自然加倍均未加倍成功，由此可以体现出基础材料对单倍体自然加倍至关重要，对单倍体自然加倍率有重要影响。通过表1中也可以得出结论，4个材料由于遗传背景的差异导致基因型不同，每个基础材料对自然加倍的适应程度不同。但从九单918可以看出，优良的气候条件对单倍体的加倍具有帮助。不同基因型基础材料通过基因的控制，通常导致雄穗育性恢复能力较差，易出现花期不遇的现象，从而导致玉米单倍体的加倍率差异。

（三）单倍体除草剂加倍率分析

表2可知，单倍体加倍过程中经除草剂处理的单倍体加倍率要极显著高于未经除草剂处理的。根据不同的除草剂浓度分析，炔苯酰草胺是以80 μmol·L-1的加倍率最高，安磺灵以60 μmol·L-1的加倍率最高，浓度60 μmol·L-1的炔苯酰草胺和浓度40 μmol·L-1的安磺灵次之，炔苯酰草胺和安磺灵均是以浓度100 μmol·L-1的最低。高浓度的除草剂毒性大，对植株幼苗损伤较大，导致植株生长发育受阻甚至死亡，单倍体加倍率低。经针刺生长点法处理的单倍体加倍率较浸芽法处理的单倍体加倍率稍高，可能是因为针刺生长点法是在玉米单倍体幼苗的生长点处进行针刺，然后注射除草剂，使除草剂直接作用于生长点，从而使单倍体达到加倍，这种方法处理精确，作用更强。在 80 μmol·L-1浓度下，炔苯酰草胺处理的单倍体加倍率要极显著高于安磺灵处理的（表3），说明了炔苯酰草胺更适宜于九单525和九单186单倍体加倍。

（四）不同基础材料的除草剂加倍率

在用80μmol·L-1的炔苯酰草胺处理九单525与九单186时，发现该浓度下的炔苯酰草胺的加倍效果最好，但 80 μmol·L-1的 炔苯酰草胺对九单186的加倍效果明显高与九单525的加倍效果。80 μmol·L-1的 炔苯酰草胺处理下，九单186的平均加倍率为27.2%。而九单525的平均加倍率为20.1%，加倍效果较好但在平均单倍体加倍率上还是以7.1%的差值低于九单186。并且与自然加倍法相比，九单186单倍体加倍率平均增加了136倍，而九单525的加倍率增加了 67倍（表 4）。说明不同的基础材料对除草剂的加倍率高低有重要影响，用炔苯酰草胺处理时，九单186比九单525更为敏感。

三、讨论

（一）不同基因型对单倍体加倍率的影响

本研究用吉科诱115在相同栽培环境下对4个基础材料进行单倍体诱导，再对4个基础材料进行单倍体加倍。通过自然加倍和除草剂加倍的结果可以发现，无论是经过自然加倍或者除草剂加倍，四个基础材料的单倍体加倍率均不同。根据前人的研究发现，不同基因型的基础材料会对单倍体的加倍率产生影响，这与本试验结论一致。不同遗传背景的材料对除草剂的适应程度不同，以及具有影响加倍的基因不同，导致部分基础材料的加倍率较高适合加倍，而部分的材料则很难进行单倍体的加倍[7-8]。为促进玉米单倍体育种技术的进一步发展，研究母本基因型对单倍体加倍率的影响成为主要方向之一。

（二）不同加倍剂对单倍体加倍效果的影响

玉米单倍体育种技术中自然加倍法的加倍率较低，无法满足大规模加倍的需求，化学加倍法中常用的秋水仙素毒素强，影响单倍体植株的生长发育和生态环境安全。通常采用能够通过抑制植物细胞微管组装形成来有效干扰细胞有丝分裂的除草剂替换秋水仙素，同样能够达到与秋水仙素相同的加倍效果，但单倍体的加倍效果也受除草剂种类、浓度和处理方式的影响[9]。本研究比较了炔苯酰草胺和安磺灵分别用浸芽法和针刺生长点法处理玉米单倍体的加倍效果，表明炔苯酰草胺的浓度为80 μmol·L-1时倍效果更好，而安磺灵的浓度为60 μmol·L-1时效果更好。高浓度安磺灵的加倍率明显低于高浓度炔苯酰草胺的加倍率，说明安磺灵的毒性更高。

四、讨论

本研究表明，采用自然加倍法时，海南试验点的气候环境更有利于种植单倍体，获得更高的单倍体加倍率，说明优良的气候环境更有利于自然加倍；采用除草剂加倍时，使用浓度为 80 μmol·L-1的炔苯酰草胺比安磺灵的加倍效果更好，本试验中的九单186比九单525更为敏感。后续可以应用浓度为 80 μmol·L-1的炔苯酰草胺，采用针刺生长点法处理单倍体九单186，提高其结实率，促进形成表现一致的稳定DH系，加快育种进程。

参考文献：

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