决明子等7种中药配方颗粒微生物限度检查方法适用性验证

【摘要】目的：建立决明子等7种中药配方颗粒微生物限度检查方法适用性。方法：参照《中华人民共和国药典》2020年版四部“通则1105、1106、1107”进行方法适用性试验。结果：采用平皿倾注法（稀释法），需氧菌计数中合欢花（合欢花）、槐花（槐花）配方颗粒（1∶50，1 mL/皿），合欢皮、槐角、皂角刺、胡芦巴配方颗粒（1∶20，1 mL/皿）；霉菌和酵母菌计数中合欢花（合欢花）配方颗粒（1∶20，1 mL/皿）、合欢皮配方颗粒（1∶50，1 mL/皿）均消除抑菌性。控制菌检查采用平皿倾注法（常规法）。结论：本方法可为决明子等7种中药配方颗粒质量控制提供参考。

【关键词】中药配方颗粒；微生物限度；适用性验证

【DOI编码】10.3969/j.issn.1674-4977.2024.06.009

Microbial Limits of Seven Traditional Chinese Medicine Formula Dranules Including Cassia Seed Verification of the Applicability of Inspection Methods

LIU Qiwen， WANG Chunlin， TIAN Xia， QIN Desong， CHEN Cheng*

（Chongqing Qianjiang Institute for Food and Drug Control Qianjiang， Chongqing 409000， China）

Abstract： Objective： Applicability of establishing microbial limit testing methods for 7 traditional Chinese medicine formula granules， including cassia seed.Method： Conduct method suitability tests according to the "General Principles 1105， 1106， 1107" in Part IV of the 2020 edition of the Pharmacopoeia of the People’s Republic of China. Result： Using the plate pouring method （dilution method），the aerobic bacterial count showed that Albizia flower （Albizia flower）， Sophora flower （Sophora flower） （1∶50， 1 mL/dish）， as well as Albizia bark，Sophora fruit，Spina gleditsiae，and Fenugreek （1∶20，1 mL/dish）； In the counting of mouldi and yeast， the antibacterial properties of the formulation particles of Albizia flower （1∶20， 1 mL/dish） and the acacia skin formulation particles （1∶50， 1 mL/dish） are eliminated. The control bacteria test is conducted using the plate pouring method （conventional method）. Conclusion： This method can provide reference for quality control of seven traditional Chinese medicine formula granules， including Cassia seed.

Keywords： traditional chinese medicine formula granules； microbial limit； applicability verification

0引言

中药配方颗粒自1993年起在我国开始试点[1]，经过20余年研究和试点生产、使用，在临床中得到广泛应用，是对传统中药的一次突破，是对中医药的传承与发展的一次创新。目前，中药配方颗粒分为两种：一种是由单味中药饮片经水加热提取、分离、浓缩、干燥、制粒而成的颗粒，另一种是单味中药经超微粉碎后制成的颗粒。中药配方颗粒属于中药饮片管理范畴，其质量控制遵循中药配方颗粒国家药品标准、地方标准和《中华人民共和国药典》2020年版四部“通则0104”。

目前，对中药配方颗粒质量标准相关的报道很多，大部分集中在特征图谱、含量测定等成分的鉴定上，但是对微生物限度的报道相对较少。而微生物限度检验作为控制药品质量的重要标志之一[2]，不仅能了解药物微生物的污染情况，对药品的动态、实时监控提供重要依据，同时还能反映药品生产工艺、清洁工艺情况，掌握其药品安全质量是否符合标准。然而，现行《中华人民共和国药典》2020年版四部对中药配方颗粒微生物限度检测方法的描述比较笼统，缺乏针对性，加上部分中药存在一定的抑菌性，其抑菌活性可能会影响药品微生物污染的真实情况[3]，导致检测数据不够准确，增加了质量监管风险。因此，针对不同品种的中药配方颗粒，要进行微生物适用性试验消除抑菌活性，但不能直接采用平皿倾注法（常规法）进行检测微生物限度[4]。

决明子、合欢花、合欢皮、皂角刺、槐角、槐花、葫芦巴都是方剂中最常见的中药饮片。多篇文献报道显示，这些中药饮片具有一定的抑菌活性，对病原微生物有不同程度的抑制作用[5-9]。因此，在对这7种中药配方颗粒进行微生物限度检查之前，必须先消除可能存在的抑菌活性。本文通过对决明子7种中药配方颗粒分别进行需氧菌、霉菌和酵母菌计数和控制菌检查方法的验证，建立能有效消除抑菌活性、试验菌回收比值和控制菌要求均符合药典规定的微生物限度方法，为行业内中药配方颗粒的微生物限度检查提供参考。

1材料

1.1样品

合欢花（合欢花）配方颗粒（批号0422002791）、合欢皮配方颗粒（批号0422001271）、决明子（钝叶决明）配方颗粒（批号0422002301）、槐角配方颗粒（批号0422003791）、皂角刺配方颗粒（批号0422002541）、槐花（槐花）配方颗粒（批号0422003421）、胡芦巴配方颗粒（批号0422004531）由重庆红日康仁堂药业有限公司生产。

1.2培养基及稀释液

胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）（批号2211112）、胰酪大豆胨液体培养基（批号220929）、麦康凯液体培养基（批号220227）、麦康凯琼脂培养基（批号2210172）、沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）（批号220304）、pH=7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（批号221018）均购自北京三药科技开发公司。氯化钠（厂家：西亚，批号20221011）。

1.3菌株

金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]、大肠埃希菌[CMCC（B）44102]、枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]均由北京三药科技开发公司生产。

1.4仪器

电子天平（梅特勒-托利多ML503-T）、生物安全柜（青岛海尔特种电器有限公司HR40-IIB2）、超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司SW-CJ-2FD）、恒温恒湿培养箱（常州市科迈实验仪器有限公司HSX-250）、霉菌培养箱（上海博讯实业有限公司BMJ-250）、立式高压蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂LDZM-80KCS-Ⅲ）。

2方法

2.1菌液制备

按照菌种说明书将“1.3”的阳性菌株用0.9%无菌氯化钠溶液稀释成菌悬液，其菌落形成单位均不大于100 cfu/ mL[10-13]。

2.2供试液制备

取样品10 g，以pH=7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液作为稀释液，依次稀释制成1∶10、1∶20、1∶50供试液。

2.3平皿倾注法（常规法）

采用常规平皿法筛查供试品有无抑制微生物生长的作用和抑制的微生物种类。分别取铜绿假单胞菌液、金黄色葡萄球菌液、枯草芽孢杆菌液、白色念珠菌液、黑曲霉菌液0.1 mL加到9.9 mL的1∶10供试液中，混匀，作为试验组；取稀释液0.1 mL加到9.9 mL的1∶10供试液中，混匀，作为供试品对照组；取上述菌液0.1 mL，加到9.9 mL稀释液中，混匀，作为菌液对照组。每组分别移取1 mL待测液置于2个无菌平皿（直径90 mm）中，然后分别倾注TSA琼脂培养基或SDA琼脂培养基[14]，混匀凝固后培养，计算平均菌落数。

2.4平皿倾注法（稀释法）

取“2.3”的菌液0.1 mL分别加到9.9 mL的1∶20和1∶50供试液中，混匀，作为试验组；取稀释液0.1 mL分别加到9.9 mL的1∶20和1∶50供试液中，混匀，作为供试品对照组；菌液对照组同“2.3”的操作一致。每组分别移取1 mL待测液置于2个无菌平皿（直径90 mm）中，然后分别倾注TSA琼脂培养基或SDA琼脂培养基，混匀凝固后培养，计算平均菌落数[15]。

2.5回收比计算

试验组回收比=（试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数）/菌液对照组平均菌落数。

3结果

3.1微生物计数检查

3.1.1平皿倾注法（常规法）

通过表1平均回收比显示，决明子（钝叶决明）配方颗粒的平均回收比均在0.5～2.0，符合《中华人民共和国药典》2020年版四部要求，表明平皿倾注法（常规法）适用决明子（钝叶决明）配方颗粒的微生物计数。而其他6种配方颗粒的平均回收比均出现小于0.5的情况。在需氧菌中，这6种配方颗粒样品均对其中一种或多种菌株有一定的抑制作用，平皿倾注法（常规法）检查不适用；在霉菌和酵母菌中，合欢花（合欢花）、合欢皮配方颗粒对白色念珠有较强抑制作用，平皿倾注法（常规法）检查不适用。

3.1.2平皿倾注法（稀释法）

根据表1结果将不适宜平皿倾注法（常规法）的配方颗粒，分别按照2.4项下方法操作，加入金黄色葡萄球菌液、铜绿假单胞菌液、枯草芽孢杆菌液、白色念珠菌阳性菌液的平皿倾注TSA琼脂，加入黑曲霉菌液的平皿倾注SDA琼脂，结果见表2。

3.1.3需氧菌计数、霉菌和酵母菌计数方法确定

根据“3.1.1”“3.1.2”的结果，得出微生物计数检查方法：需氧菌计数中，决明子（钝叶决明）配方颗粒常规（1∶10），合欢皮、槐角、皂角刺和胡芦巴配方颗粒稀释（1∶20），合欢花（合欢花）、槐花（槐花）配方颗粒稀释（1∶50）；霉菌和酵母菌计数中，合欢花（合欢花）配方颗粒稀释（1∶20），合欢皮配方颗粒稀释（1∶50），其他5种配方颗粒常规（1∶10）。

3.1.4正式试验

根据“3.1.3”的方法，每种样品取1批次，进行2次独立试验，计算平均回收比，试验结果见表3。

按照“3.1.3”的方法进行需氧菌计数、霉菌和酵母计数实验，合欢花（合欢花）、合欢皮、决明子（钝叶决明）、槐角、皂角刺、槐花（槐花）、胡芦巴配方颗粒各菌株平均回收比均在0.5～ 2.0范围内，符合标准，表明该试验方法可行。

3.2控制菌检查

3.2.1常规法

取2.2项下1∶10供试液10 mL，加到100 mL TSB中混匀，作为供试品组；取1∶10供试液10 mL和大肠埃希菌液0.1 mL，加到100 mL TSB中混匀，作为试验组；取稀释液10 mL，加到100 mL TSB中，作为阴性组；按照《中华人民共和国药典》2020版四部通则方法检查。

3.2.2稀释法

取“2.2”制备的1∶20供试液代替1∶10供试液，按照“3.2.1”配制供试品组、试验组、阴性组，同法检查。

3.2.3结果

在常规法、稀释法中试验组均检出阳性菌，样品组和阴性组均无菌落生长，符合《中华人民共和国药典》2020年版四部“1106规定”，表明这7个配方颗粒对大肠埃希氏菌无抑制作用，均适用常规法进行控制菌（大肠埃希菌）检查。

4讨论

近年来对中药饮片微生物污染情况[16-18]的研究与探讨日益增多，体现了微生物限度的重要性。无论是在生产工艺和质量监管上，还是客观反映人、机、料、法、环等诸多因素上，微生物限度都是评价药品安全性的重要指标，是辅助监管部门综合评判风险的关键因素之一。因此，对中药配方颗粒建立合理有效的微生物检测方法尤其重要。

微生物限度检查方法适用性采用平皿倾注法（常规法），通过试验发现常规法不能满足规定要求。部分中药配方颗粒对某些微生物有一定抑制作用，平均回收比不在0.5～2.0范围内，需要消除抑菌性。本文采用稀释法使样品的抑菌活性减弱，保障定量试验结果准确性。在需氧菌计数检查中，合欢花（合欢花）、槐花（槐花）配方颗粒采用平皿倾注法（稀释法）（1∶50，1 mL/皿），合欢皮、槐角、皂角刺、胡芦巴配方颗粒采用平皿倾注法（稀释法）（1∶20，1 mL/皿）均可消除抑菌性。在霉菌和酵母菌计数检查中，合欢花（合欢花）配方颗粒采用平皿倾注法（稀释法）（1∶20，1 mL/皿）、合欢皮配方颗粒采用平皿倾注法（稀释法）（1∶50，1 mL/皿）能消除抑菌性。在控制菌检查中，大肠埃希菌采用平皿倾注法（常规法）符合标准规定。

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【作者简介】

刘琪雯，女，1990年出生，工程师，学士，研究方向为药品和化妆品质量检测。

通信作者：陈琤，女，1980年出生，副主任药师，学士，研究方向为药品和化妆品质量检测与管理，462436881@qq.com，19102372755。

（编辑：侯睿琪）