恩诺沙星片含量均匀度测定方法的建立

【摘要】目的：为了建立恩诺沙星片中恩诺沙星含量均匀度的测定方法。方法：采用高效液相色谱法，以0.025 mol/L磷酸溶液（用三乙胺调节pH值至3.0）-乙腈（83∶17）为流动相，色谱柱为Waters Xbridge C18（250 mm×4.6 mm，5μm），流速为1.0 mL/ min，柱温为35℃，检测波长为278 nm；进样体积为10μL。结果：恩诺沙星的峰面积积分值在20.50～102.52μg/mL范围内具有良好的线性关系（r=0.9999），平均回收率达到99.9%，RSD=0.4%，含量均匀度的平均值（A+2.2S）分别为98.4%（5.2）、93.2%（11.0）、95.5%（10.1）、107.1%（14.8）。结论：该方法简便、准确、可靠，适用于恩诺沙星片含量均匀度的测定。

【关键词】恩诺沙星片；含量均匀度；高效液相色谱法

【DOI编码】10.3969/j.issn.1674-4977.2024.06.005

Establishment of Test for Content Uniformity in Enrofloxacin Tablets

HAN Chunxiao， GAO Hongqian， XU Bin， XU Lijia， LI Yan

（Liaoning Inspection ，Examination&Certification〔Liaoning Institute forAgro-product Veterinary Drugs and Feed Control〕， Liaoning Key Laboratory of Livestock Product Safety， Shenyang 110036， China）

Abstract： Objective： To establish the method for content uniformity of compound enrofloxacin tablets. Method： The mobile phase is 0.025 mol / L phosphoric acid solution （adjust pH to 3.0 with triethylamine） - acetonitrile （83∶17）， the HPLC column is Waters Xbridge？C18 column （250 mm×4.6 mm）， the flow rate is 1.0 mL/min， the column temperature is 35℃， the detection wavelength at 278 nm， and injection volumes are 10μL. Result： The linear range of syringing is 20.50～102.52μg/mL （r=0.9999）. The average recovery （n=9） is 99.9 % （RSD=0.4%）， the averages （A+2.2S） of the content uniformity are 98.4%（5.2）、93.2%（11.0）、95.5%（10.1）、107.1%（14.8）. Conclusion： The method is simple，accurate，reliable and suitable for content uniformity determination of enrofloxacin tablets.

Keywords： enrofloxacin tablets； content uniformity； high performance liquid chromatography

恩诺沙星（简称ENRO）是动物专属的喹诺酮类抗菌药，主要用于细菌性疾病和支原体感染的防治[1]。它对包括假单胞菌素属在内的大部分革兰氏阴性菌具有很强的杀灭作用，对部分革兰氏阳性菌也有良好的抗菌效果，同时对某些支原体、衣原体、立克次氏体也显示出有效性[2-4]，常用于肠炎、肺炎、子宫内膜炎、乳腺炎、皮肤病及一些软组织感染的治疗[5]。目前，ENRO在兽医临床上已得到广泛应用，特别是在用于治疗禽病的片剂中普遍含有该药，同时在宠物用药中也有广泛的应用。

含量均匀度是药品质量控制的基础。依据《中华人民共和国兽药典》附录“0941含量均匀度检查法”的规定，对于标示量不大于10 mg的片剂，应进行含量均匀度的检查。《中华人民共和国兽药典》所收录的恩诺沙星片规格为2.5 mg和5 mg。《中华人民共和国兽药典》2015年版对恩诺沙星片含量均匀度没有要求[6-7]。根据兽药国家标准制修订计划，本中心完成了恩诺沙星片含量均匀度方法的建立，并且此方法已被收录在《中华人民共和国兽药典》2020年版一部中。

1仪器与试药

1.1仪器

Waters 2695型高效液相色谱仪，配紫外检测器；梅特勒公司生产的AX205DR型电子天平；梅特勒公司生产的S220型pH计；昆山市超声仪器有限公司生产的KQ-250DE型数控超声波清洗器；5 mL注射器；0.22μm滤膜。

1.2试药

恩诺沙星对照品购自中国兽医药品监察所（批号为H0081505，纯度为99.5%）；恩诺沙星片分别购自成都乾坤动物药业股份有限公司（批号：20180601，20180602，20180603；规格：5 mg），赣州华医动物药业有限公司（批号：20180110；规格：2.5 mg）；实验用水为自制超纯水，乙腈为色谱纯，磷酸和三乙胺采用分析纯。

2方法与结果

2.1色谱条件

采用含量测定项下的色谱条件。以Waters Xbridge C18（250 mm×4.6 mm，5μm）为色谱柱，0.025 mol/L磷酸溶液（用三乙胺调节pH值至3.0）-乙腈（83∶17）为流动相，流速为1.0 mL/min，柱温为35℃，检测波长为278 nm，进样量为10μL。

2.2溶液配制

配制对照品溶液：精密称取恩诺沙星对照品（经105℃干燥至恒重），置于25 mL容量瓶中，用流动相溶解，振摇，再用流动相定容，振摇均匀，即制成质量浓度约为2 mg/mL的对照品贮存液。精密量取5 mL，用流动相稀释定容至200 mL，摇匀，即制成对照品溶液。

配制供试品溶液：取样品1片（5 mg）置于100 mL容量瓶中或者取样品1片（2.5 mg）置于50mL容量瓶中，加流动相约40 mL，超声30 min使其溶解，加流动相稀释定容，摇匀，经0.22μm滤膜过滤后制成供试品溶液。

阴性对照溶液的制备：去除恩诺沙星片中的恩诺沙星制备空白片剂，并使用与供试品溶液相同的制备方法进行制备。

溶剂空白溶液：取流动相适量经0.22μm滤膜过滤。

2.3方法学考察

2.3.1干扰性试验

在高效液相色谱仪中分别注入空白溶液、阴性对照溶液、对照品溶液和供试品溶液各10μL。色谱图（图1至图4）显示，供试品溶液与对照品溶液在相同保留时间处有色谱峰，阴性对照溶液和溶剂空白溶液在恩诺沙星保留时间处无色谱峰，这表明其他成分及辅料对恩诺沙星含量测定无影响。

2.3.2线性关系考察

精密量取恩诺沙星对照品贮存液，用流动相稀释定容，按上述方法进行分析，将恩诺沙星溶液的质量浓度分别稀释为20、40、60、80、100μg/mL。线性回归方程以溶液的质量浓度为横坐标，以峰面积积分值为纵坐标，线性回归方程为：y= 69687.555x-62687.1（r=0.9999）。结果显示，溶液浓度在20.50～102.52μg/mL内，浓度和峰面积积分值有着良好的线性关系。

2.3.3精密度试验

取对照品溶液注入液相色谱仪，连续6次进样，每次进样量为10μL，根据色谱图计算峰面积。连续6次恩诺沙星溶液的峰面积RSD为0.14%，表明仪器系统精密度符合要求。

2.3.4重复性试验

取同一批的恩诺沙星片样品（20180601），按照上述的方法配制6份供试品溶液，分别注入液相色谱仪，每份的进样体积均为10μL。根据色谱图的积分峰面积同法进行试验，RSD为0.74%，表明方法重复性符合要求。

2.3.5稳定性试验

取批号为20180601的恩诺沙星片样品，按照上述方法配制供试品溶液，在与整个试验环境相同的条件下静置一段时间，然后分别于0、4、8、16、24 h注入液相色谱仪，每次注入10μL，根据色谱图计算峰面积。结果显示，恩诺沙星的RSD为0.9%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.6加样回收试验

取恩诺沙星片剂中的其他成分，置于9个100 mL容量瓶中，然后分别加入0.8、1.0、1.2 mL对照品贮存液，相当于处方量的80%、100%、120%，每个浓度有3个恩诺沙星对照品平行样。加流动相超声，按供试品溶液方法配制，根据上述色谱条件测定，并根据色谱图色谱峰面积，以外标法计算回收率。结果见表1。

2.3.7耐用性试验

取同一供试品溶液和对照品溶液，调整柱温为30℃、35℃、40℃，或改变流速为0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.2 mL/ min。以上色谱条件的微小改变对分离效果、含量测定均无明显影响。

2.4样品含量均匀度测定

取成都乾坤动物药业股份有限公司和赣州华医动物药业有限公司生产的恩诺沙星片样品各10片，制备供试品溶液，按“2.1”的色谱条件进行测定。按外标法测定峰面积，计算样品含量，根据《中国兽药典》2015年版（通则0941）计算含量均匀度，结果均符合要求。详见表2。

3讨论与结论

恩诺沙星片含量均匀度的检测方法依据《中华人民共和国兽药典》（通则0941）。除另有规定外，通常L值为15.0，对于某些特殊剂型或情况，L值可能为20.0或25.0。所测试的样品已符合标准，且存在通过提升生产工艺可进一步优化的空间，同时本版兽药典中含量均匀度与《中华人民共和国药典》《美国药典》的宽松度一致。本试验所选批次的片剂之间含量差异较大，兽药生产厂家应该提高药品生产水平和工艺，如减少重量差异和优化混合工艺等，以提高药物的混合均匀性，加强对药品含量均匀度的质量控制。

由于本品在所选溶剂中较易崩解，且为了更加准确地定量计算，本试验未采取研磨转移的方法，但同时比较了振摇和超声两种方法对含量的影响，发现振摇和超声对含量测定结果无明显影响，30 min后溶解度不再增加，因而选择超声30 min处理样品。

本品采用《中华人民共和国兽药典》中恩诺沙星片含量的测定方法，结果符合《中华人民共和国兽药典》（通则0941）含量均匀度检查法的要求。采用上述方法可以对恩诺沙星片进行含量均匀度的检测。

【参考文献】

[1]应翔宇，杨永胜.兽用新型抗菌药物：恩诺沙星[J].中国兽药杂志，1995，29（3）：53-56.

[2]吴海坤，方炳虎，时书宁，等.恩诺沙星混悬液的研制及其在鸡组织中的残留研究[J].动物医学进展，2010，31（4）：47-52.

[3]梁静，李超，黄俊，等.复方氨酚烷胺片（胶囊）中主成分含量均匀度测定[J].中国药业，2023，32（23）：7-12.

[4]苏思尹.吲达帕胺片含量均匀度测定方法影响因素的探讨[J].中国药品标准，2018，19（4）：317-320.

[5]田洁，车宝泉，田菁.HPLC法测定复方利血平片中6个成分的含量均匀度[J].药物分析杂质，2018，38（9）：1634-1640.

[6]纪建勋.对比2015版《中国药典》与《美国药典》中含量均匀度检测法[J].中国卫生标准管理，2017（8）：65-67.

[7]国家药典委员会.中国药典分析检测技术指南[M].北京：中国医药科技出版社，2017.

【作者简介】

韩春晓，女，1986年出生，高级畜牧师，硕士，研究方向为兽药检测和质量标准制修订。

（编辑：李钰双）