QuEChERS-高效液相色谱-串联质谱法测定淡水鱼中地西泮及孔雀石绿的残留量

【摘要】目的：采用高效液相色谱-串联质谱法同时测定淡水鱼中地西泮和孔雀石绿的残留量。方法：采用QuEChERS前处理技术，利用高效液相-串联质谱法对目标物进行测定。结果：孔雀石绿和地西泮在0.1～2.0 ng/mL范围内线性关系良好，回收率在95.1%～106.7%，检测限为0.1μg/kg，定量限为0.5μg/kg。结论：本法灵敏度高，操作简单，结果准确可靠，可同时测定淡水鱼中孔雀石绿和地西泮的残留量。

【关键词】高效液相色谱-串联质谱法；淡水鱼；地西泮；孔雀石绿

【DOI编码】10.3969/j.issn.1674-4977.2024.06.003

【基金项目】辽宁省应用基础研究计划项目（2022JH2/101300076）：食品安全非靶向筛查及溯源识别关键技术研究。

Determination of Diazepam and Malachite Green Residues in Freshwater Fish by QuEChERS-HPLC-MS/MS

CHEN Yuwei， ZHOU Ziren， ZHAO Lei， GAO Guanghui*

（Liaoning Inspection Examination and Certification Centre， Shenyang 110036， China）

Abstract： Objective： To determine the residues of diazepam and malachite green in freshwater fish simultaneously by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （HPLC-MS/MS）. Methods： The QuEChERS pretreatment technology was used， and the target compounds were determined by HPLC-MS/MS. Results： Malachite green and diazepam showed good linearity in the range of 0.1～2.0 ng/mL， with recoveries ranging from 95.1% to 106.7%， a detection limit of 0.1μg/kg， and a quantification limit of 0.5μg/kg. Conclusion： This method is sensitive， easy to operate， and the results are accurate and reliable. It can be used for the simultaneous determination of malachite green and diazepam residues in freshwater fish.

Keywords： HPLC-MS/MS； freshwater fish； diazepam； malachite green

地西泮（Diazepam，C16H13ClN2O）又名安定[1]，具有镇静、抗惊厥等作用，属于苯二氮卓类镇静剂，是兽医临床上用来使动物恢复平静，减轻或消除动物狂躁不安的药物[2-4]。如果人们长期食用地西泮残留超标的水产品，会导致中枢神经系统受到严重干扰。很多国家将地西泮列为在水产动物捕捞以及运输过程中禁止使用的药物。GB 31650—2019《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》规定，地西泮仅允许治疗使用，但进入市场前不得检出。

孔雀石绿属于人工合成的三苯甲烷类碱性工业染料，在水中主要代谢为脂溶性的隐色孔雀石绿。孔雀石绿进入人类或动物机体后，通过生物转化还原代谢成脂溶性的隐色孔雀石绿，其毒性要比孔雀石绿还强，具有高残留、高毒和致癌、致畸、致突变危害，严重威胁人们的身体健康[5]。《中华人民共和国农业农村部公告第250号》已将孔雀石绿列为禁用物质，规定在淡水鱼中不得qJpPdbiOj3jfmX6T2UYGJQ==检出。

地西泮的检测依据SN/T 3235—2012《出口动物源食品中多类禁用药物残留量检测方法液相色谱-质谱/质谱法》，孔雀石绿的检测依据GB/T 19857—2005《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》。本文采用QuEChERS+高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）同时测定地西泮和孔雀石绿，不仅满足了方法的准确性，还极大地提高了基层检验机构的工作效率。

1材料与方法

1.1仪器、试剂及样品来源

串联四极杆液质联用仪（美国赛默飞公司），对照品地西泮、孔雀石绿草酸盐（纯度为98.0%）、隐色孔雀石绿（纯度为94.0%）、内标氘代孔雀石绿（纯度为99.4%）和氘代隐色孔雀石绿（纯度为98.5%）均购于德国Dr.Ehrenstorfer公司。

乙腈、甲酸（Sigma公司）均为色谱纯；水为Millipore超纯水；其他试剂均为分析纯。

本研究采用的样品为从市场中通过多阶段分层随机购买的鲫鱼、鲤鱼、黑鱼、草鱼等淡水鱼，包括活体淡水鱼。

1.2溶液制备

1.2.1标准品溶液的制备

称取地西泮、孔雀石绿、隐色孔雀石绿、d5-孔雀石绿和d5-隐色孔雀石绿标准品适量，用乙腈稀释制成0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 ng/mL系列标准溶液（内标质量浓度为1.0 ng/mL）。

1.2.2样品溶液的制备

将鱼去头、鳞、刺后捣碎，称取已捣碎的样品5.00 g，置于50 mL离心管中，加入50μL内标溶液（500μg/L），精密加入25 mL乙腈，10，000 r/min匀浆提取30 s，加中性氧化铝3 g，涡旋2 min，3500 r/min离心10 min，取上清液3 mL，加正己烷1 mL，涡旋2 min，3500 r/min离心10 min，弃去正己烷层，取乙腈层用0.2μm滤膜滤过后，作为供试品溶液。

1.3检测方法

1.3.1色谱及质谱条件

色谱柱：Waters C18 column（2.1 mm×50 mm，1.7μm）；流动相：0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）；柱温：30℃；进样量：2μL，梯度洗脱程序见表1。

离子源：电喷雾正负离子模式（ESI+），扫描模式为多反应监测（MRM）模式；毛细管压力：3500 V（Postive Ion），2500 V（Negative Ion）；鞘气流速：50Arb；辅助气流速：10Arb；吹扫气流速：0Arb；离子传输管温度：325℃；脱溶剂温度：350℃。

1.3.2测定方法

取标准品溶液及样品溶液各2μL，注入液质联用仪，采用标准曲线法计算含量。

2实验方法与结果

2.1仪器条件优化

首先将0.5μg/mL待测化合物的标准溶液分别以流动注射的方式在正离子模式下进行母离子全扫描，确定分子离子，然后对其子离子进行全扫描，优化碰撞能量等参数，得到孔雀石绿、隐色孔雀石绿和地西泮的最佳质谱条件。孔雀石绿、隐色孔雀石绿及其内标、地西泮检测参数见表2，色谱图见图1至图6。

2.2方法的线性范围及检出限

将系列标准溶液按照“1.3”的方法进行检测，以待测物质量浓度为横坐标，待测物峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标绘制标准曲线。结果表明，地西泮、孔雀石绿及其代谢物在0.1～2 ng/mL范围内线性关系良好，能够满足样品的定量分析需求。检出限（以3倍信噪比S/N=3计）及定量限（以10倍信噪比S/N=10计）结果见表3。

2.3回收率及精密度实验

以空白基质为样品，在0.5、1、5μg/kg这3个水平下进行加标回收实验，平行测定6个样品，计算加标回收率，结果见表4。

2.4样品测定结果

选取淡水鱼中地西泮阳性样品，进行自建方法和国标方法比对，精确度符合要求。

2.5结果分析

本研究建立了一种同时检测水产品中孔雀石绿和地西泮残留量的检测方法，其线性范围、检出限、定量限和加标回收率等指标均满足GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范食品理化检测》的要求。将阳性样品测定的结果同标准方法进行比较，相对偏差≤15%，满足GB/T 27404—2008的精密度要求。同时，本研究所建立的前处理方法也能大大节约前处理时间。原来采用抽检细则指定的方法每天只能提取20批样品，而采用本研究所建立的前处理方法每天可以处理50批样品，这极大地提高了检验人员的工作效率。

3结束语

通过QuEChERS/HPLC-MS/MS法测定淡水鱼中的孔雀石绿和地西泮残留量。根据孔雀石绿和地西泮的性质，对样品采用乙腈提取，用中性氧化铝净化后，又用正己烷去除脂溶性杂质。该方法易于操作，简便快速。经方法学验证，该方法的回收率、精密度和准确度能够满足水产品中兽药残留分析的要求。

【参考文献】

[1] TAKAI Y，TOKUSUMI H，SATO M，et al.Combined effect of diazepam and polystyrene microplastics on the social behavior of medaka（Oryzias latipes）[J].Chemosphere，2022，299：134403.

[2]李存，皇甫伟国，杨挺，等.液相色谱串联质谱法快速测定猪尿中10种镇静剂类药物残留量[J].分析化学，2010，38（7）：1015-1018.

[3] DEKOSKY S T，WILLIAMSON J B. The long and the short ofbenzodiazepines and sleep medications：Short-term benefits，long-term harms[J]. Neurotherapeutics，2020，17（1）：153-155.

[4]张祖维，李木子，李雪莲，等.液相色谱-串联质谱法测定猪尿液中地西泮及其7种代谢物残留[J].中国动物检疫，2021，38（3）：112-118.

[5]张蓓蓓，赵永刚.加速溶剂萃取/超高效液相色谱-串联质谱法测定沉积物中三苯甲烷类杀菌剂[J].分析测试学报，2016，35（10）：1328-1332.

【作者简介】

陈玉威，女，1978年出生，高级工程师，研究方向为食品质量与安全。

通信作者：高广慧，女，1976年出生，主任药师，研究方向为食品质量与安全。

（编辑：李钰双）