高效液相色谱-串联质谱法同时测定凉茶中5种α-受体阻断剂

关键词

分析化学 凉茶 高效液相色谱-串联质谱法 α-受体阻断剂

0引言

凉茶是以中草药为基础研制浸提出来的具有清热解毒、生津止渴等功效的一类植物源性饮料[1]。凉茶产业发展迅猛，不仅在传统的凉茶市场（广东、广西地区）发展劲头十足，甚至在全国也开始掀起凉茶风潮[2]。行业快速发展的同时，激烈的市场竞争也带来不少问题[3]，一些不法厂商由于利益驱使，在凉茶中违规加入如酚妥拉明、妥拉唑林、哌唑嗪、特拉唑嗪和育亨宾等具有降血压功效的α-受体阻断剂[4，5]药物，该类药物可竞争性阻断神经递质或α受体激动剂与α受体的结合，从而产生抑制α受体激动的作用，降压疗效确切，起效快。消费者在不知情的情况下长期服用该类“降压茶”后，会引起血压波动及稳定性差异变大、产生强依赖性或停药效应、甚至影响肝脏生物转化能力及肾脏代谢能力等危害[6]。

目前，针对酚妥拉明、妥拉唑林、哌唑嗪、特拉唑嗪和育亨宾等5种α-受体阻断剂的检测，常见的方法主要为薄层色法[7]该方法局限于定性快筛；其次，还有紫外分光光度法[8]、荧光法[9，10]，但这两种检测手段无法同时测定多种成分，且检出限及定量限较高，难以实现痕量检测；作为常用检测手段的高效液相色谱法[11-13]，高效液相色谱-串联质谱法[14-16]，已有的研究主要以保健食品及药品为基质，或是围绕凉茶中防感冒、抗炎、止咳等功效的违法添加药物开展研究[17]，目前暂时没有针对凉茶中这类α-受体阻断剂药物建立相应的强制性标准，或者无法解决样品基质导致回收率偏低的问题。因此建立一种简便、灵敏、快捷的可同时检测“降压茶”中5种α-受体阻断剂的检测方法，对于规范我省凉茶产业生产经营，引导广东凉茶行业阳光发展，具有重要的现实意义。

本研究以凉茶为基质，样品经净化后，外标法定量，建立一种可同时分离检测凉茶中5种α-受体阻断剂的测定方法，可填补现阶段的凉茶及其制品检测监控手段空白。

1材料与方法

1.1材料与试剂

甲醇（分析纯，天津致远化学试剂有限公司）。甲醇、甲酸、乙腈（色谱纯，FishChemical）。盐酸酚妥拉明（纯度98.0%，批号：S70897，质量浓度100.1μg/mL）、盐酸哌唑嗪（纯度99.9%，批号E0029403）、盐酸特拉唑嗪（纯度97%，批号S098201，质量浓度100.0μg/mL）、盐酸育亨宾（纯度98.8%，批号2250583）、盐酸妥拉唑林（纯度95.3%，批号E0027187）。样品：随机选取市售的30批次凉茶。

1.2仪器与设备

超高效液相色谱-串联质谱仪、IKAMS3涡旋混合器、高速冷冻离心机、JJ500Y电子天平、Milli-Q超纯水纯化系统。

1.3方法

1.3.1标准溶液的配制

1.3.1.1储备液配制

盐酸酚妥拉明（纯度98.0%）：100.1μg/mL，经纯度及盐量修正，酚妥拉明质量浓度为86.7μg/mL；盐酸哌唑嗪（纯度99.9%）：称取盐酸哌唑嗪0.00810g于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，经纯度及盐量修正，配制成质量浓度为739μg/mL的哌唑嗪储备液；盐酸特拉唑嗪（纯度97.0%）：100μg/mL，经纯度及盐量修正，特拉唑嗪质量浓度为88.7μg/mL；盐酸育亨宾（纯度98.8%）：称取盐酸育亨宾0.00950g于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，经纯度及盐量修正，配制成质量浓度为851μg/mL的育亨宾储备液；盐酸妥拉唑林（纯度95.3%）：称取盐酸妥拉唑林0.00950g于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，经纯度及盐量修正，配制成质量浓度为737μg/mL的妥拉唑林储备液。

1.3.1.2中间液配制

酚妥拉明中间液：准确移取116μL酚妥拉明储备液于1.5mL进样瓶中，加入884μL甲醇，配制成质量浓度为10μg/mL的酚妥拉明中间液；哌唑嗪中间液：准确移取136μL哌唑嗪储备液10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成质量浓度为10μg/mL的哌唑嗪中间液；特拉唑嗪中间液：准确移取113μL特拉唑嗪储备液1.5mL进样瓶中，加入887μL甲醇，配制成质量浓度为10μg/mL的特拉唑嗪中间液；育亨宾中间液：准确移取118μL育亨宾储备液10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成质量浓度为10μg/mL的育亨宾中间液；妥拉唑林中间液：准确移取136μL妥拉唑林储备液10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成质量浓度为10μg/mL的妥拉唑林中间液。

1.3.1.3混合标准溶液的配制

准确移取200μL质量浓度为10μg/mL的酚妥拉明、哌唑嗪中间液、100μL质量浓度为10μg/mL的特拉唑嗪、育亨宾中间液、800μL质量浓度为10μg/mL的妥拉唑林中间液于10mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成质量浓度为200ng/mL的酚妥拉明、哌唑嗪；100ng/mL的特拉唑嗪、育亨宾；800ng/mL的妥拉唑林混合标准工作液。准确移取上述混合标准工作液于各容量瓶中，用甲醇稀释配制成以下质量质量浓度，酚妥拉明、哌唑嗪的标准工作曲线范围为：0.5ng/mL～50ng/mL；特拉唑嗪、育亨宾的标准工作曲线范围为：0.25ng/mL～25ng/mL；妥拉唑林的标准工作曲线范围为2ng/mL～200ng/mL，标准品、储备液、中间液、工作液于-20℃冷冻保存。

1.3.2其余溶剂的配制

0.1mol/LHCl：准确移取9mL盐酸溶液于1000mL容量中，用水定容至刻度；盐酸甲醇（20∶80）：准确移取20mL0.1mol/LHCl于100mL容量中，用甲醇定容至刻度；5%氨水甲醇溶液：准确移取5mL氨水溶液于100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。

1.3.3样品前处理

准确称取约1g（准确至0.01g）试样于15mL离心管中，加入10mL盐酸甲醇，涡旋混匀5min，待下一步净化，取MCX固相萃取柱（60mg/3mL，在填料相同规格的条件下，可用相近柱管替代），先用6mL甲醇及6mL水活化，上样后先后用2mL水、1mL甲醇淋洗，最后用5mL氨水甲醇洗脱，洗脱液于40℃下氮吹干，甲醇定容至10mL容量瓶中，过0.45μm有机滤膜，待测。

1.3.4仪器条件

色谱柱：ACQUITYBEHC181.7μm2.1×100mm；柱温：40℃；进样量：5μL；流动相：A为0.1%甲酸水溶液，B为乙腈；流速：0.25mL/min；梯度洗脱；实验过程中流动相梯度见表1。

质谱条件：离子源：电喷雾离子源（ESI）；检测方式：多反应监测（MRM）；扫描方式：正离子模式；喷雾电压：5500V；气帘气：35Psi；加热温度：550℃；喷雾气：50Psi；辅助加热气：50Psi；监测离子对等信息详见表2。

2结果与分析

2.1色谱及质谱条件优化

试验参考BJS201808[18]流动相体系进行优化，以优化分析时长，兼顾批量检测为目的，尝试以乙腈0.1%甲酸水、0.1%甲酸乙腈0.1%甲酸水为流动相体系。通过试验证明，以乙腈0.1%甲酸水为流动相，初始乙腈比例为20%，分析时长为5.5min，妥拉唑林、特拉唑嗪、哌唑嗪、育亨宾、酚妥拉明5种待测物可依次出峰，但妥拉唑林出现双峰情况，需进一步优化液相条件，降低初始流动相乙腈比例为10%，分析时间调整为6min，5种化合物出峰顺序不变，且可解决妥拉唑林出峰不正常情况；保持原有梯度不变，有机相改为0.1%甲酸乙腈，5种成分出峰时间略有提前，但无明显差异，因此，最终选择乙腈0.1%甲酸水作为流动相。

5种目标检测成分的质谱参数经优化后，见表2。

2.2前处理条件优化

为定量准确，结合5种待测成分的的化学特质，试验以甲醇作为提取溶剂，以料液比为1：10进行提取，监测加标回收率，但凉茶中成分复杂[19]，含有多种有机酸和黄酮苷类等成分，直接提取后检测受基质影响大，容易导致回收率偏低，且凉茶种类多，难以选择合适的空白基质作基质曲线。因此试验向阴性样品中添加1倍定量限、2倍定量限，10倍定量限3个浓度水平的混合标准溶液，完成加标、提取步骤后，分别用HLB、MCX、MAX固相萃取柱对提取液进行净化，以加标回收率综合评价提取及净化效果，结果如表3所示。

根据GB27404—2008《实验室质量控制规范食品理化检测》附录F的要求，当添加量＜0.1mg/kg时，回收率范围为60%～120%，直接提取试验中，回收率为56.3%～88.8%，相对标准偏差RSD为0.78%～3.95%，受基质背景影响，5个待测成分中，哌唑嗪的回收率出现低于60%的情况，而经过常用的针对中等极性的酸性中性碱性的HLB固相萃取柱净化后，除妥拉唑林外，其余4种化合物回收率均大于60%；针对哌唑嗪及妥拉唑林回收率不高的情况，借鉴受体阻断剂常用的MCX、MAX固相萃取柱进行净化后，MAX固相萃取柱对各化合物的保留不强甚至出现不保留现象，回收率大部分＜60%，而经过具有反向及阳离子交换双重保留性能的MCX柱后，回收率在70.9%～96.3%，该表现优于直接提取及HLB柱净化，应用该固相萃取柱净化后，准确度及精密度均符合定量要求，可用于日常凉茶中5种α-受体阻断剂的检测。

2.3方法的线性范围、检出限及定量限

按照2.3.1方法配制混合标准工作溶液，按1.3.4中确定的色谱和质谱条件进样，以峰面积为纵坐标Y，质量浓度为横坐标X，外标法作线性回归方程。以3倍信噪比（S/N=3）确定方法的检出限，10倍信噪比（S/N=10）为方法的定量限。结果表明，5种α-受体阻断剂在各自的浓度范围内呈现良好的线性关系，线性相关系数均大于0.994。5种α-受体阻断剂的线性方程、相关系数、检出限及定量限见表4。

2.4实际样品测定

采用本研究建立的方法对广东省市售的30批次凉茶进行检测，均未发现上述5种α-受体阻断剂的非法添加情况，但由于凉茶种类众多，且非法添加情况可能集中在自制自售的凉茶作坊，因此，建立5种α-受体阻断剂的高效检测方法，进行持续跟踪具有一定的现实意义。

3结论

本研究建立了一种同时测定凉茶中5种α-受体阻断剂的高效液相色谱-串联质谱检测方法，对色谱条件及前处理条件进行了优化，采用WatersACQUITYUPLC（BEHC181.7μm）色谱柱分离，以甲酸水（0.1%）和乙腈为流动相进行梯度洗脱，采用多反应监测正离子模式（ESI+），6min内可完成所有组分检测，可有效缩短分析时间，经过MCX柱净化可降低多种基质效应，结合LOD、LOQ、回收率等方法学考察。该方法简便、高效，能为凉茶中α-受体阻断剂的的检测提供科学基础。