猪苓菌核形成条件优化研究

摘 要：猪苓作为一种药用真菌，在医药界备受青睐，但由于野生资源逐渐匮乏，开展猪苓人工栽培已成为一种趋势。本试验从湿度、黑曲霉ZM-8液、生物素的使用等几方面探究猪苓菌核快速形成的最佳配方。研究结果表明：黑曲霉ZM-8的加入，有助于猪苓菌核和蜜环菌菌索的形成与生长。适宜浓度的生物素对猪苓菌核的形成也有极大的促进作用。在四种主要影响因素中，湿度水平对猪苓菌核形成影响最大。控制培养基湿度50%；黑曲霉ZM-8液25 mL；三十烷醇12 mg/kg；萘乙酸15 mg/kg的条件最适宜猪苓菌核的形成。该条件下培养30 d猪苓菌核直径可达32.8 mm。

关键词：猪苓；蜜环菌；菌核；条件优化

中图分类号：R282.2" 文献标识码：A" 文章编号：0488-5368（2024）10-0052-05

收稿日期：2024-02-05 修回日期：2024-03-13

基金项目：渭南职业技术学院2023年度院级科研计划项目（WZYYZ202309）。

第一作者简介：郭楠（1988-），女，硕士，研究方向为药用真菌基础研究。

Study on Condition Optimization for Sclerotial Formation "of %Polyporus Umbellatus%

GUO Nan1， ZHANG Zongzhou2

（1.Weinan Vocational and Technical College， Weinan， Shaanxi 714026， China; 2.School of Bioengineering and Biotechnology， Tianshui Normal University， Tianshui， Gansu" 741001， China）

Abstract： %Polyporus umbellatus %is a medicinal fungus that is highly valued in the pharmaceutical industry. Due to the gradual depletion of wild resources， artificial cultivation of Polyporus umbellatus has become a trend. This study investigated the optimal formula for the rapid formation of sclerotia in %Polyporus umbellatus% from several aspects， including humidity， Aspergillus niger ZM-8 liquid concentration， and biotin supplementation. The results indicate that the introduction of %Aspergillus niger% ZM-8 significantly enhances the formation and growth of both sclerotia and %Armillaria mellea %rhizomorphs. Additionally， an appropriate concentration of biotin plays a crucial role in promoting sclerotial formation. Among the four main factors tested， the optimal conditions for sclerotial formation of %Polyporus umbellatus %were identified as： medium humidity at 50%， 25 mL of %Aspergillus niger %ZM-8 liquid， 12 ppm of 30 alkanol （specify if possible）， and 15 ppm of NAA. Under these conditions， the diameter of %Polyporus umbellatus% sclerotia could reach up to 32.8 mm after 30 days.

Key words：%Polyporus umbellatus; Armillaria mellea; %Sclerotium; Condition optimization

猪苓是一种珍贵的真菌类中药材［1］，属担子菌门、多孔菌科、多孔菌属[5，12]。猪苓味甘、性平，有利水、消肿的功效［2］，中医临床上常用于治疗急性肾炎、全身浮肿、小便不畅、尿急尿频、急性肝炎等疾病。随着医药事业的快速发展，以猪苓为原料的成品药不断开发，保护猪苓野生资源，开展猪苓人工栽培势在必行［3］。

猪苓的生长发育需经过担孢子、菌丝体、菌核和子实体四个阶段。担孢子在适宜的条件下萌发成菌丝和次生菌丝，构成菌丝体，无数菌丝缠绕构成菌核。菌核多年生，能贮存营养，环境不适时可长期休眠，遇蜜环菌和适宜的环境能萌生菌丝，串破菌核表层[4，10]，形成白苓，进而开始下一轮无性繁殖过程。猪苓菌核具有利水、渗湿、消肿等功能，其多糖对动物移植性肿瘤有抑制作用[5]。猪苓菌核国内及出口用量大，野生资源日益减少，虽然利用蜜环菌伴栽猪苓菌核人工栽培[8，9]和菌丝发酵[6]已获得成功，但由于猪苓菌核生长缓慢、繁殖率低、种苓缺乏，为此很难提供大量猪苓菌核用于人工栽培，限制了猪苓栽培的规模。

人工室内促生猪苓种，即人工培养猪苓菌核，可以为半人工栽培猪苓提供无限的种源，又能打破猪苓栽培的时空限制，推动猪苓栽培业的发展。同时，猪苓栽培的第一步也是研究猪苓菌核的形成问题，也就是如何让猪苓孢子在最适的培养条件下形成大量的菌丝，又让这大量的菌丝交织在一起快速的形成丰满的菌核，这是目前亟待解决的问题，也是猪苓人工栽培中最难解决的问题。本研究的目的是找到猪苓菌核形成的最佳外界条件，掌握猪苓菌核形成的基本规律，以推动猪苓菌核的产业化生产。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 猪苓原种、蜜环菌原种由天水师范学院微生物研究室提供的杂木屑原种。

1.1.2 原料 锯末、麸皮、马铃薯、玉米面、大豆面、蛋白胨、白糖、石膏粉等。

1.1.3 培养基配方 锯末75%、麦麸14%、玉米面5%、大豆面2%、蛋白胨1%、白糖1%、多维磷酸二氢钾1%、石膏粉1%、加猪苓宝2#0.3%，加水至含水55%左右。

1.1.4 器材 高压灭菌锅（上海申安医疗机械厂）电子天平、恒温培养箱（上海恒科技有限公司）、酒精灯、培养皿、电炉、量筒、500 mL三角瓶、250 mL菌种瓶、500 mL菌种瓶、滤纸、多个1 mL移液管。

1.2 方法

1.2.1 蜜环菌、猪苓栽培种培养将配料拌匀，装瓶，松紧适度，中间插一孔，用棉花做塞子，灭菌。分别接种猪苓、蜜环菌菌种，25 ℃培养30 d。后置于黑暗条件下培养30 d，注意观察。

1.2.2 猪苓菌核形成条件优化

（1）黑曲霉ZM-8对蜜环菌菌索和猪苓菌核形成的影响。

黑曲霉对猪苓菌核和蜜环菌菌索的形成有促进作用，是偶然发现的。之后我们着意用几种黑曲霉感染，取得了较好的效果。培养基配方同上。分别接种野生黑曲霉、黑曲霉UV-11、黑曲霉ZM-8各1 mL，对照不接，重复6次。其中3次接种猪苓菌种，另外3次接种蜜环菌菌种。培养30 d，取3个样的平均数。

（2）生物素对猪苓菌核的促进作用[11]。考虑到猪苓生长速度比较缓慢，一般自然界一年才能形成猪苓种，三年以上才能长成商品猪苓，为促生猪苓种，我们引入了生物素试验。

1#处理：马铃薯100 g；白糖10 g；牛肉膏5 g；KH-2PO-4 2 g；琼脂8 g；自来水500 mL（马铃薯煮化）。制成500 mL特殊的PDA培养基。灭菌，并倒成20个培养皿，每皿加灭过菌的中性滤纸一张。加生物素液0.5 mL。生物素液配方：萘乙酸5 mg/kg；10 mg/kg；15 mg/kg；20 mg/kg的浓度，分别形成1#A、1#B、1#C、1#D四个处理，每处理4个重复。对照1#CK，不加生物素，重复4个。只接种猪苓菌种，25℃培养30 d。

2#处理：培养基配方同上。加生物素液0.5 mL，生物素液配方：萘乙酸5 mg/kg；10 mg/kg；15 mg/kg；20 mg/kg的浓度，分别形成2#A、2#B、2#C、2#D四个处理，每处理4个重复。对照2#CK，不加生物素，重复4个。同时接种猪苓菌种和蜜环菌菌种，25 ℃培养30 d。

3#处理：培养基配方同上。加生物素液0.5 mL，生物素液配方：三十烷醇4 mg/kg；8 mg/kg；12 mg/kg；16 mg/kg的浓度，分别形成3#A、3#B、3#C、3#D四个处理，每处理4个重复。对照3#CK，不加生物素，重复4个。只接种猪苓菌种，25 ℃培养30 d。

4#处理：培养基配方同上。加生物素液0.5 mL，生物素液配方：三十烷醇4 mg/kg；8 mg/kg；12 mg/kg；16 mg/kg的浓度，分别形成4#A、4#B、4#C、4#D四个处理，每处理4个重复。对照4#CK， 不加生物素，重复4个。同时接种猪苓菌种和蜜环菌菌种，25 ℃培养30 d。

1.2.3 条件优化（萘乙酸、三十烷醇、黑曲霉ZM-8液、湿度）[7] 黑曲霉ZM-8液的制作方法：称取5 g黑曲霉ZM-8，加500 mL水浸泡在三角瓶中10 h，置高压蒸汽灭菌锅中灭菌后使用。

在前面实验的基础上，这次重点讨论萘乙酸、三十烷醇、黑曲霉ZM-8液、湿度等四因素对猪苓菌核形成的影响。我们设置四因素三水平正交试验。萘乙酸5 mg/kg、10 mg/kg、15 mg/kg；三十烷醇4 mg/kg、8 mg/kg、

12 mg/kg；黑曲霉ZM-8液15 mL、20 mL、25 mL；培养基湿度50%、60%、70%。设置9个处理，每处理5个重复，共1个对照。将配料拌匀，装入培养皿，每皿约10 g左右，保持皿内培养基疏松。灭菌，接种猪苓菌种，25 ℃培养30 d，统计生长结果。

2 结果与分析

2.1 黑曲霉ZM-8对蜜环菌菌索和猪苓菌核形成的影响

菌核的形成是猪苓产生的第一步，由表1可以看出：野生黑曲霉对猪苓菌核的产生有益，30d菌核平均可达13.2 mm；接种黑曲霉UV-11，菌核平均可达14.4 mm；接种黑曲霉ZM-8，菌核平均可达16.8 mm，而不接黑曲霉的对照样品在30 d根本无法产生菌核。试验结果可知接种黑曲霉ZM-8，菌核大而饱满，不接黑曲霉的对照组菌丝较白，但无菌核产生。蜜环菌菌索的生长也受黑曲霉的影响，接种野生黑曲霉，蜜环菌菌索30 d平均可达17 mm；接种黑曲霉UV-11，蜜环菌菌索30 d平均可达34 mm；蜜环菌菌索接种黑曲霉ZM-8，30 d平均可达51 mm，而不接黑曲霉的对照样品在30 d菌索长度只有8 mm。由此说明，黑曲霉不影响蜜环菌菌索的产生，但影响蜜环菌菌索的生长速度，特别是接种黑曲霉ZM-8，蜜环菌菌索的长度是对照组的6.38倍，影响相当之大。这一发现将成为猪苓生产中的一个重要措施。

2.2 生物素对猪苓菌核形成的影响

从表2可以看出，生物素—萘乙酸、三十烷醇的加入，都能在一定程度上促进猪苓菌核的形成。1#处理只接种猪苓菌种，在萘乙酸浓度10 mg/kg时达到高峰，猪苓菌核直径18.5 mm，比不加萘乙酸的处理菌核直径大

14.2 mm。2#处理接种猪苓菌种和蜜环菌菌种，在萘乙酸浓度10" mg/kg时达到高峰，猪苓菌核直径20.5 mm，比不加萘乙酸的处理菌核直径大12.5 mm。3#、4#处理加的三十烷醇，在8" mg/kg时达到高峰，菌核分别比不加三十烷醇大10.2 mm和8.5 mm。且相同加量下，生物素浓度越高，猪苓菌核生长速度越慢。同时认为加萘乙酸比加三十烷醇的效果更好。另一方面，在萘乙酸浓度10" mg/kg和三十烷醇浓度8" mg/kg时，同时接种蜜环菌和猪苓菌种的2#和4#比只接种猪苓菌种的1#和3#菌核直径大2 mm，由此说明：蜜环菌能为猪苓提供营养，也说明猪苓可以脱离蜜环菌自己吸收营养。在营养充足的情况下，猪苓是可以单独生长的，打破了猪苓必须依靠蜜环菌提供营养才能生长的定势思维。

2.3 条件优化（萘乙酸、三十烷醇、黑曲霉ZM-8液、湿度、）的正交试验结果

在条件优化中，猪苓菌核形成条件的正交实验因素水平如表3，不同因素的正交试验结果（L-9（34））如表4。设计的因素与因素水平，是在原来单因素试验的基础上确定的。

从表4可以看出，培养基湿度水平的极差、ZM-8液水平的极差、三十烷醇水平的极差和萘乙酸水平的极差分别是12.4、10.83、8.03和1.7。说明在环境条件的确定中，湿度对猪苓菌核生长的影响最大，湿度的改变明显影响猪苓的生长及大小；萘乙酸水平对猪苓菌核生长的影响最小。在9个处理中，处理3的猪苓菌核直径最大，可达32.8 mm，处理6的猪苓菌核直径最小，仅9.8 mm。处理3菌核直径是处理6菌核直径的3.35倍，所以认为处理3的条件适宜猪苓菌核的形成。也就是控制空气湿度50%；黑曲霉ZM-8液25 mL；三十烷醇12 mg/kg；萘乙酸15 mg/kg的条件最适宜猪苓菌核的形成。在这个条件下30 d，猪苓菌核直径可达32.8 mm，这样大小的猪苓菌核可以直接用于猪苓生产。

3 小结与讨论

3.1 单因素试验讨论

3.1.1 黑曲霉ZM-8对蜜环菌菌索和猪苓菌核形成的影响

在自然界可能也存在促进猪苓菌核形成的因素。我们在实验中偶然发现，形成猪苓菌核的培养基被黑曲霉感染后不会阻碍猪苓菌核的形成，反而会促进猪苓菌核的形成。之后，采用几种黑曲霉去侵染，取得了较好的结果，实验结果表明黑曲霉可以促进猪苓菌核的形成，特别是黑曲霉ZM-8菌株。黑曲霉ZM-8可以促进猪苓菌核的产生和膨大，也能促进蜜环菌菌索的伸长，接种黑曲霉ZM-8蜜环菌菌索的长度是对照的6.38倍。

3.1.2 生物素对猪苓菌核形成的影响 生物素—萘乙酸、三十烷醇的加入，都能在一定程度上促进猪苓菌核的形成。仅接种猪苓菌种的处理，在萘乙酸浓度10 mg/kg达到高峰，猪苓菌核直径18.5 mm，比不加萘乙酸的处理菌核直径大14.2 mm。接种猪苓菌种和蜜环菌菌种，在萘乙酸浓度10 mg/kg达到高峰，猪苓菌核直径20.5 mm，比不加萘乙酸的处理菌核直径大12.5 mm。加三十烷醇，在8 mg/kg时达到高峰，分别比不加三十烷醇菌核大10.2 mm和8.5 mm。在生物素影响猪苓菌核形成的过程中我们还发现，猪苓可以独立吸收营养，形成菌核，也可以借助蜜环菌的菌索提供营养形成菌核，蜜环菌的存在有助于猪苓菌核的产生与生长。

3.2 条件优化（萘乙酸、三十烷醇、黑曲霉ZM-8液、湿度）的正交试验讨论

在四种主要影响因素中，培养基湿度水平对猪苓菌核形成影响最大，黑曲霉ZM-8液影响次之。培养基相对最佳湿度是50%。条件优化中认为：控制培养基湿度50%；黑曲霉ZM-8液25 mL；三十烷醇12 mg/kg；萘乙酸15 mg/kg的条件最适宜猪苓菌核的形成。在这个条件下30 d，猪苓菌核直径可达32.8 mm。黑曲霉ZM-8液的加入启发我们，它在猪苓菌核形成的培养基中可能充当着某种营养成份，有待进一步研究。

促生猪苓种，即人工培养猪苓菌核，可以为栽培猪苓提供无限的种源，又能打破猪苓栽培的时空限制，推动猪苓栽培业的发展。

参考文献：

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