“陕西主料”烟叶优势菌群鉴定及微生物发酵烟叶技术研究

摘 要：以“陕西主料”烟叶为材料，检测烟叶自带菌群的种类及数量，分别使用单一菌和复配菌对片烟进行发酵处理，结合评吸结果，探究微生物发酵对卷烟品质的改善作用。结果表明，“陕西主料”烟叶中优势菌类群为细菌，真菌次之，未分离到酵母菌和放线菌；细菌主要为芽孢杆菌。分离得到的5号菌株有较强的淀粉水解能力。微生物发酵后烟叶的总糖和淀粉含量随发酵时间呈现出下降趋势，总氮和还原糖呈现出先降低后增加的变化趋势。芽孢杆菌发酵可改变烟叶中的一些组分，改善各组分不同的比例，对卷烟具有增香提质的作用。

关键词：陕西主料烟叶；微生物发酵；烟叶；增香提质

中图分类号：S572" 文献标识码：A" 文章编号：0488-5368（2024）10-0032-07

收稿日期：2023-11-22 修回日期：2024-01-04

第一作者简介：高明博（1986-），男，硕士，农艺师，主要从事烟叶生产栽培及技术推广工作。

通信作者：胡颖梅。

Identification of Dominant Microflora on Tobacco Leaves in

'Shaanxi Main Materials' and Research on Microbial Fermentation "Techniques for Tobacco Leaves

GAO Mingbo1， HU Yingmei1， QIN Mingqian2， YANG Baowei2

（1.Shaanxi Provincial Company of China National Tobacco Company， Xi’an， Shaanxi 710061， China;

2.Zhangjiakou Center for Disease Prevention and Control， Zhangjiakou， Hebei 075000， China;

3.College of Food Science and Engineering， Northwest Aamp;F University， Yangling， Shaanxi 712100， China）

Abstract：" In this study， the type and quantities of the native microflora present on 'Shaanxi main materials' tobacco leaves were investigated. The effects of both single bacterial strains and mixed bacterial cultures on the fermentation of tobacco were evaluated， alongside sensory assessment results， to explore how microbial fermentation can enhance cigarette quality. The results showed that the dominant microbial group was bacteria， followed by fungi， while yeast and actinomycetes were not isolated. Bacillus was the main bacterium. The isolated strain No. 5 had a strong starch hydrolysis ability. After microbial fermentation， the total sugar and starch content of tobacco leaves decreased with fermentation time， while the total nitrogen and reducing sugar decreased initially and then increased. Bacillus fermentation can change some components in tobacco leaves， improve the different proportions of each component， and enhance the flavor and quality of cigarettes.

Key words：Shaanxi main material tobacco; Microbial fermentation; Tobacco; Aroma and quality enhancement

品质优良的烟叶表面携带大量的微生物，在烟叶陈化或发酵过程，这些微生物会作用于烟叶，能够改善其色泽和香气，有效降低刺激性，对提高烟叶的品质和经济价值有着重要作用[1]。烟叶发酵可分为自然发酵和人工发酵2种形式[2]。研究表明，人工发酵能够在可控条件下转化烟叶中淀粉和果胶等大分子物质，提高卷烟香气量、烟气浓度和细腻感等吸食品质，大大缩短发酵时间。但是，目前仍存在人工发酵后烟叶品质的改善效果不如自然发酵好的问题[3]。因此，筛选适于烟叶发酵的微生物、优化发酵工艺参数、改善人工发酵过程成为烟草行业的一个研究热点[4]。

本研究对“陕西主料”烟草携带的微生物菌群种类和数量进行检测，筛选鉴定优势菌株。采用单一和复配菌作为菌种对“陕西主料”片烟进行发酵处理，以期改善陕西主料烟香气物质及组成结构，提高陕西烤烟工业适配性，拓展烤烟应用范围，为陕西烤烟发展提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 烟叶 陕西主料片烟SXZL和成品片烟（陕西商洛C3FTY99、陕西商洛C3FTY87、SXZL、SXTW）由咸阳烟叶复烤有限责任公司提供。

1.1.2 菌株 5号芽孢菌SXYY从陕西主料烟叶上分离得到；短小芽孢杆菌A（%Bacillus pumilus %van35）、解淀粉芽孢杆菌B（%Bacillus amyloliquefaciens%）和高地芽孢杆菌C（%Bacillus altitudinis%）购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。

1.1.3 培养基 PDA培养基、孟加拉红培养基、高氏一号培养基、营养琼脂培养基、MRS培养基等均购自北京陆桥技术股份有限责任公司。

1.1.4 仪器和设备 超净工作台（SW-CJ-1CU；苏州苏洁净化设备有限公司），高压灭菌锅（ES-315；日本Tomy公司），百分之一天平（XS204；梅特勒），恒温摇床（上海智成分析仪器制造有限公司），浊度仪（法国梅里埃），超纯水处理器（美国Millipor公司），－80 ℃低温冰箱（日本Sanyo公司），移液器、高速离心机（德国Eppendorf公司），Mycycler PCR 仪、DNA电泳、凝胶成像系统 （美国Bio-Rad公司），恒温水浴仪（宁波赛福实验仪器厂）。

1.2 方法

1.2.1 微生物分离、计数和保藏 样品处理：将10 g烟叶加入90 mL无菌水，150 r/min震荡15 min，得到10-1梯度稀释液。10倍系列稀释后分别得到10-2和10-3梯度稀释液，备用。

细菌分离：吸取100 μL不同浓度的稀释液，滴加至LB培养基，涂布均匀后在28 ℃培养。每个梯度设2个重复，使用无菌水作为对照。培养结束后，挑选菌落数适宜的培养基进行计数，得到烟叶携带的细菌种类及数量。

真菌分离：吸取100 μL不同浓度的稀释液，滴加至PDA和孟加拉红培养基，涂布均匀后在28 ℃培养。每个梯度设2个重复，使用无菌水作为对照。培养结束后，挑选菌落数适宜的培养基进行计数，得到烟叶携带的真菌种类及数量。

放线菌分离：吸取100 μL不同浓度的稀释液，滴加至高氏一号培养基，涂布均匀后在28 ℃培养。每个梯度设2个重复，使用无菌水作为对照。培养结束后，挑选菌落数适宜的培养基进行计数，得到烟叶携带的放线菌种类及数量。细菌采用甘油/LB肉汤、真菌使用甘油/生理盐水保存于-80 ℃冰箱，备用。

乳酸菌分离：吸取100 μL不同浓度的稀释液，滴加至MRS培养基，涂布均匀后在28 ℃培养。每个梯度设2个重复，使用无菌水作为对照。培养结束后，挑选菌落数适宜的培养基进行计数，得到烟叶携带的乳酸菌种类及数量。

细菌采用甘油/LB肉汤、真菌使用甘油/生理盐水保存于-80 ℃冰箱，备用。

1.2.2 细菌的鉴定 本研究只对分离得到的细菌进行鉴定。采用煮沸结合离心法提取总DNA，以其为模板；使用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增[5]。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送至测序公司测序。测序结果提交GenBank数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）进行同源基因搜索（BLAST Search），将搜索所得序列与已知序列进行比对，使用MEGA6.0、采用Neighbor-Joining法进行1 000 次Bootstrap检验后构建系统发育树，鉴定“陕西主料”烟叶上细菌的种属。

扩增用正向引物-F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向引物-R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT -3’。扩增条件：94 ℃ 10 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，35个循环；72 ℃ 10 min。PCR 扩增片段为1 500 bp。

1.2.3 细菌菌液浓度确定 将保存在-80 ℃的菌株划线接种到LB琼脂培养基，37 ℃培养18～20 h后，取1～2个单菌落，接种至100 mL LB肉汤培养基，37 ℃、120 r/min摇床中培养18～20 h；将得到的菌液在4 ℃、10 000 r/min条件下离心10 min，弃去上清液，加入无菌去离子水重悬；使用浊度仪调整菌液OD-600值在0.48～0.52，备用。

1.2.4 淀粉水解试验 向LB琼脂培养基中补加0.5%（g/V）的可溶性淀粉，点接种纯化后的细菌，28 ℃培养48 h后，向培养基上滴加100 μL碘液染色，观察菌落周围是否有透明圈。用透明圈的相对大小表示淀粉水解能力的大小。

1.2.5 芽孢菌剂厌氧条件陕西主料烟发酵试验 由于没有对研究中分离得到的细菌进行安全性评价，因此没有使用分离株进行烟叶发酵研究。本研究使用目前报道的对烟叶增香、品质改善效果较好的短小芽孢杆菌（%Bacillus pumilus %van35）、解淀粉芽孢杆菌（%Bacillus %amyloliquefaciens）和高地芽孢杆菌（%Bacillus %altitudinis）作为菌剂，分别采用单一菌种和复配菌剂对“陕西主料”片烟进行发酵，试验设计具体信息见表1。复配菌剂由OD值（浓度约为：×108 CFU/mL）相同的单一菌剂按1∶1（v∶v）配制而成。将菌剂和烟叶按照1∶4（mL∶g）的比例无菌条件下进行雾化接种。将接种后的片烟装入无菌的铝箔袋，抽真空后封口，室温下自然发酵，分别在0 d、7 d、15 d、45 d取样。取样后一部分烟叶在40 ℃烘干，用于化学指标测定；另一部分在80 ℃烘干，用于评吸试验。

1.2.6 片烟化学成分测定 将处理后的样品送至送陕西太阳景检测有限公司，分别测定未发酵和不同发酵时期片烟中总糖、还原糖、总氮和淀粉含量。总糖含量依据《YC/T 159-2002》、采用连续流动法进

行测定[6]，还原糖含量采用 3，5-二硝基水杨酸比色法[7]测定，淀粉含量采用GB 5009.9第一法酶解法[8]测定，总氮含量采用靛酚蓝分光光度法[9]测定。

1.2.7 评吸试验

（1）烟支卷制 将烟丝置于38 ℃下干燥去湿，调节烟丝含水率至12%左右，然后采用相同规格的卷烟纸和滤棒进行手工卷制。评吸前置于相对湿度为60%、温度为22℃下平衡48 h，方可进行感官评吸。

（2）评吸方法 由陕西中烟工业有限责任公司技术中心7人组成评吸小组进行综合评价，按照GB5606.4-2005[10]评吸质量指标和评分标准对发酵前、后的烟叶进行评吸，按照香气质、香气量、浓度、劲头、杂气、刺激性和余味等指标进行感官评价，确定较好的发酵菌剂和相应的发酵时间。

2 结果与分析

2.1 微生物分离结果

“陕西主料”烟叶中优势菌主要为细菌，其次为真菌，未分离到酵母菌和放线菌。将菌落特征高度相似的菌株分为一类，选取不同种类的非乳酸菌类细菌和霉菌，对其进一步的纯化、保藏。3次分离检测结果表明陕西主料烟叶上微生物类群及组成比例为非乳酸菌类细菌：乳酸菌：真菌（PDA培养基分离）：真菌（孟加拉红培养基分离）=74.2∶28.4∶21.3∶2.1（表2）。共分离得到4株产芽孢细菌，5株真菌。

2.2 细菌鉴定结果

芽孢杆菌多产生淀粉酶，烟叶中的淀粉被适量水解后可以减轻不愉快的焦糊味。因此，本试验只针对芽孢杆菌进行研究。以NCBI登陆号为BD224045.1的沙门氏菌作为外参菌，以登录号为MN960344的芽孢杆菌作为内参菌，构建的分子进化树（图1）。分离到的4株细菌均可鉴定为芽孢杆菌。

2.3 芽孢杆菌淀粉水解试验

培养、染色结束后，如菌落周围出现透明圈则表明可产生淀粉酶，透明圈越大表明淀粉酶产生能力越强。

结果表明分离得到的4株芽孢菌中有1株可产生淀粉酶，且其产生能力和解淀粉芽孢杆菌商品株相当（图2）。其余菌株或不产生淀粉酶，或产生能力较低。

2.4 芽孢菌发酵陕西主料烟叶

分别采用短小芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和高地芽孢杆菌的单一菌剂和复配菌剂对成品片烟固态发酵后，发酵烟叶总糖、总氮、还原糖和淀粉含量变化如图3～6所示。

结果表明，分别使用单一菌种或复合菌剂发酵烟叶后，与未发酵样品相比，其中的总糖和淀粉含量总体上呈下降趋势，且随着发酵时间延长含量越低；总氮和还原糖发酵早期呈现出下降趋势，随着发酵进行含量又逐步上升，未呈现出比较规律的变化趋势。

2.5 发酵烟叶评吸结果

评吸专家在同一条件下分别对发酵前、后烟叶样品的感官评吸结果表明，与未发酵烟叶相比，微生物发酵后烟叶香气量平均增加3.4%，最高增加5%；刺激性平均降低7%，杂气平均减弱4%，劲头足平均下降6.9%，烟气膨松，甜感有所提升，烟叶的吸食品质得到有效改善。随着发酵时间的延长，品质改善越明显，有较独特的产品风格，工业可用性较强。

3 讨论

陕西烟叶具有出叶片率高、安全性高、氯含量低、燃烧性优等特点，但与云南、贵州和津巴布韦烟叶相比，存在工业适配性不高，烟叶中香气量与香气质不足，青杂气和土杂气较重等问题[11]，严重制约着陕西烟叶的销售和推广。烤烟中淀粉、蛋白质、水溶性糖和其他含氮化合物含量越高，燃烧时产生的刺激性越大，烟叶的燃烧性就越低。以此同时，这些物质也是烟气中有害物质的前体[12]。因此，适当降低和转化烟叶中的一些组分对提高成品烟吸食品质十分重要，但目前通过微生物发酵来实现此目标的研究仍然较少。

本研究中，我们对陕西主料烟叶自带微生物的种群进行了定量分析，结果显示主要类群为细菌和霉菌。这与赵铭钦[13]对河南烤烟的烟叶优势微生物分离筛选研究结果比较相似。表明这些微生物可能是烟叶中的常居菌，它们的存在对烟叶烤制后自然陈化过程中品质进一步改善和提高发挥着重要作用。以烟叶陈化期间品质变化为基础，探求微生物的生命活动动态变化以及微生物之间的协同关系[14，15]对烟叶品质改良的影响，可为烟叶品质提升提供更深层次的理论依据。

为了加快烤烟的陈化速度，加快其中淀粉、蛋白质和其他多糖的水解和转化速度，使烟叶中的一些组分在微生物的作用下达到一个比较合适的含量和比例，提高成品香烟的吸食品质，本研究分别采用了3株对淀粉、纤维素和果胶水解能力较强的芽孢菌，分别采用单一菌株和复合菌剂对4种陕西主料烟叶进行发酵，以期提高其适配性和吸食品质。从发酵总体趋势分析来看，微生物发酵后总糖和淀粉含量均呈现出随发酵时间延长而下降的趋势，总氮和还原糖含量总体变化不明显。单一菌株和复配菌株发酵后可使烟叶中的淀粉、总糖和还原性糖含量有不同程度的降低，但复配菌株对它们的降解能力并不是单一菌株降解作用的累加，这可能是由于不同组合微生物的生命活动产生的水解酶及其水解作用影响了这些大分子物质的含量。微生物在代谢过程中会利用淀粉等大分子物质作为碳源以维持生命活动[16]，从而降低了淀粉的含量。然而，由于微生物的持续作用，可能导致发酵后期代谢产生的还原糖含量升高。一般情况下，总氮含量在发酵后会下降，而本研究中其含量基本无变化或有些许升高，可能是由于烟叶本身的酶系可以降解烟叶中的含氮化合物，使其再发酵初期含量下降，但后期可能因为微生物菌体数量增加，导致总氮含量有所升高。前期的研究发现，微生物发酵烟叶的过程会发生一系列化学反应，代谢产生的氨基酸和糖类还可能进一步反应，生成的新物质可以改善烟叶的色泽，提高外观品质[17]。

目前，提高陕西烟叶工业适配性的关注点主要是改善和提高烤烟内在化学品质，增加烟叶香气物质种类和含量，这也是烟叶提质增效的关键技术。其中，常用的增香剂有美拉德反应产物、糖类物质和酶制剂等[18]，主要对烤后烟叶进行处理。樊文举[19]研究了喷施一定量酶溶液对烤制后烟叶的理化指标影响，发现不同酶处理对烤后烟叶的色泽、表面形态和热解特性产生了一定的影响。孙伟峰[20]利用酶法和外加香料法对下部烟叶进行增香提质，提升了品质较差的下部烟叶的利用率。本研究采用发酵的方法，在不添加增香剂条件下对烟叶进行微生物发酵处理后，对陕西主料烟叶的增香提质作用产生了显著的效果，同时还响应了国家烟草专卖局提出的“减害降焦”战略目标[21，22]，为陕西烟叶产业的发展提供了关键技术支撑与借鉴。

4 结论

“陕西主料”烟叶中优势菌类群主要为细菌，经16S rDNA序列分析鉴定均为芽孢杆菌，其中优势分离菌株5号菌具有有较强的淀粉水解能力。通过单一菌株和复配菌株对成品烟发酵处理后，有效改善了烟叶淀粉、总糖、还原糖、总氮的含量和比例。经过微生物发酵技术改进的“陕西主料”烟叶吸食品质优良，有效提升了烟叶品质，形成了陕西烟叶产品的特有风格，为提高“陕西主料”烟叶的工业适配性和经济价值提供了理论和技术支持。

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