谷子细胞色素P450基因与株高的关联分析

摘 要： 通过对160份谷子材料进行重测序，在CYP450基因内共检测到48个SNP位点，所有位点都位于编码区。基于SNP位点的群体结构分析将160份谷子材料划分为2个群，第一群包括137个品种，主要来自河南省、河北省、内蒙古等地方，第二群包括23个品种，主要来自辽宁省、陕西省等地方。对谷子生长素应答蛋白基因的48个SNP位点来进行的连锁不平衡的结构分析，当R2=1时，有一组明显较大的连锁不平衡的结构，包括7个SNP位点，分别为SNP-3、SNP-8、SNP-12、SNP-13、SNP-14、SNP-18、SNP-35，这些基因位点都位在于编码区外显子中。GLM模型和MLM模型共有的谷子CYP450基因SNP位点有7个，分别是SNP-16、SNP-17、SNP-21、SNP-28、SNP-31、SNP-39、SNP-43。在这7个谷子CYP450基因SNP位点3个为错义突变，分别是SNP-16氨基酸由Leu突变为Ile，SNP-17氨基酸由Leu突变为Val，SNP-28氨基酸由Gly突变为Ser，其余4个为无义突变。本研究初步证明谷子CYP450基因与株高有密切关联，为进一步研究CYP450基因对谷子株高的调控作用提供了有力的依据。

关键词：谷子；重组自交系；农艺性状；主基因+多基因；遗传模型

中图分类号：S515" 文献标识码：A" 文章编号：0488-5368（2024）10-0005-08

收稿日期：2023-12-04 修回日期：2023-12-31

基金项目：河南省重点研发专项（231111110300）;河南省现代农业产业技术体系（S2020-14）;河南省农业良种联合攻关项目（2022010401）;国家现代农业产业技术体系专项（nycytx-CARS-06）;河南省中央引导地方科技发展资金项目（Z20221341070）;河南省农科院科技创新团队（2023TD036）。

第一作者简介：秦家范（1972-），男，副研究员，主要从事谷子遗传育种工作。

通信作者： 王自力，贾小平。

Correlation Analysis of Cytochrome P450 Gene and Plant Height "in Foxtail Millet %（Setaria italica） %

QIN Jiafan1，TIAN Lu2，LI Xiaoyan1，ZHANG Xiaomei2，LIU Zhongling1，LIU Hui2， HAN Judong1，CHU Yingying1，JIA Xiaoping2，WANG Zili1

（1.Luoyang Academy of Agriculture and Forestry Sciences， Luoyang， Henan 471022， China； 2.College of Agriculture， Henan University of Science and Technology， Luoyang， Henan 471023， China）

Abstract： By resequencing 160 'Setaria italica' materials， 48 SNP sites were detected in the CYP450 gene， all located within the coding region. Population structure analysis based on these SNP loci divided the 160 %Setaria italica %materials into two groups. The first group， consisting of 137 varieties， was primarily from Henan， Hebei， Inner Mongolia， and other regions. The second group， comprising 23 varieties， was mainly from Liaoning， Shaanxi， and other areas. A linkage disequilibrium analysis of the 48 SNP sites in the %Setaria italica %auxin response protein gene revealed that， when R2 = 1， a significantly larger linkage disequilibrium structure was present， which included 7 SNP sites： SNP-3， SNP-8， SNP-12， SNP-13， SNP-14， SNP-18， and SNP-35， all located within exons of the coding region. There were 7 SNP loci in the %Setaria italica% CYP450 gene identified by both the GLM and MLM models： SNP-16， SNP-17， SNP-21， SNP-28， SNP-31， SNP-39， and SNP-43. Of these 7 SNP sites， 3 were missense mutations： SNP-16 involved a Leu to Ile mutation， SNP-17 involved a Leu to Val mutation， and SNP-28 involved a Gly to Ser mutation， while the remaining 4 were nonsense mutations. This study provides preliminary evidence that the %Setaria italica% CYP450 gene is closely related to plant height， laying a strong foundation for future efforts to regulate plant height in %Setaria italica% via CYP450 gene manipulation.

Key words：%Setaria italica; %CYP450; Plant height; SNP locus; Association analysis

谷子（%Setaria italica%）属禾本科，古称稷、粟、亦称粱。谷子的染色体为2n=18。谷子最先出现在中国大陆，其在作物中享有\"百谷之长\"的美誉，并位居首位。谷子适应能力强，适宜种植在海

拔1 000 m以下和23～32 ℃的环境下，属于耐旱、耐贫瘠、抗逆性强的高产量农作物[1]。广泛种植于我国北方和黄河中上游地区，其他地区也有种植，我国种植总面积占世界播种面积九成左右[2～10]。

细胞色素P450（cytochromeP450，简称CYP450）代表着一个很大的可自身氧化的亚铁血红素蛋白家族，是单氧酶的一种，因其在450 nm有特异吸收峰因此命名为CYP450[3]。在内源性物质和外源性物质的代谢和活动中具有重要的作用。依照氨基酸序列的同源程度，其成员又依次分为家族、亚家族和酶个体三级。在许多植物中发现细胞色素P450类蛋白对生育期、木质素有重要影响进而影响作物株高，对植物株型结构的形成有调控作用[4]。

如今有关谷子的研究在生物技术方面广泛涉及，但是针对谷子细胞色素P450基因与株高之间的关系相对较少，他们之间存在着什么样的联系呢？本实验将会对谷子细胞色素P450基因与株高进行关联分析，本研究通过重测序分析160份谷子材料细胞色素P450基因的突变位点，同时在洛阳连续两年测定160份谷子的株高，用TASSEL软件GLM和MLM两种模型开展CYP450基因突变位点与株高的关联分析，发掘与株高紧密关联的SNP标记，探寻其之间的紧密关系。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取的160份谷子材料包括来自中部（河南省、山东省、河北省）、西北部（陕西省、新疆省、甘肃省、青海省、宁夏省、西藏省、山西省）、东北部（黑龙江省、吉林省、辽宁省、）和内蒙高原等国内各地区的品种资源144份，还有来自日本、美国、朝鲜、德国等国外的品种资源16份。

1.2 试验方法

1.2.1 谷子材料的种植及株高调查 2021年、2022年连续两年将160份谷子材料种植于洛阳市农林科学院试验田，每个品种种植1行，株距3～5 cm，行距50 cm左右，定期浇水施肥。成熟期选取每行中部10株测量株高，取平均值作为最终的测量值。

1.2.2 160份谷子材料基因组DNA提取及重测序 谷子出苗一周左右，取新鲜幼嫩叶片，采用CTAB法进行160份谷子材料基因组DNA的提取。将质量检测合格的DNA样品送至深圳华大基因进行重测序，开发SNP标记。

1.2.3 CYP450基因突变位点与株高的关联分析 把两年所测的160份谷子材料株高数据按照软件要求进行格式整理，利用TASSEL5.0软件中的GLM和MLM两种模型进行CYP450基因突变位点与株高间的关联分析。

1.2.4 谷子CYP450基因的生物信息学预测 从phytozome数据库（https：//phytozome.jgi.doe.gov/）下载获得谷子CYP450的基因组序列、CDS序列及推定的蛋白质序列，基于 Swiss‐model（http：//swissmodel.expasy.org/）在线分析工具同源建模的自动模式进行的谷子CYP450基因应答蛋白的三维结构预测。应用在线软件Protparam（https：//web.expasy.org/protparam/）对谷子CYP450基因蛋白质性质测定。

1.2.5 基于CYP450基因 SNP位点的160份谷子材料群体结构分析 根据重测序获得的CYP450基因SNP位点信息，用STRUCTURE2.0软件分析160份谷子材料的群体结构。

1.2.6 CYP450基因 SNP位点间的连锁不平衡（LD）分析 运用TASSEL5.0软件分析CYP450基因SNP位点间的连锁不平衡关系。

2 结果与分析

2.1 谷子CYP450基因生物信息学分析

从phytozome数据库获得CYP450基因的基因组序列1 300 bp，包含完整编码区域（图1）。基因的CDS序列全长为1 119 bp（图2），推定的蛋白质序列为372个氨基酸（图3）。

对CYP450基因编码的蛋白序列进行分析发现谷子CYP450蛋白的分子量为107 355.75 kD，等电点为4.92，其不稳定系数（Instability index）达到51.20，为不稳定的蛋白质，谷子CYP450蛋白总平均亲水性为0.896，表明谷子CYP450蛋白为疏水蛋白，谷子CYP450蛋白不含任何跨膜结构域，不属于膜蛋白，可能位于细胞质中。谷子CYP450蛋白的三维结构预测表明该蛋白包含8个α螺旋，8个无规则卷曲，9个β折叠组成，含2个结构域（图4）。

2.2 谷子CYP450基因SNP位点筛选

基于重测序结果在160份谷子CYP450基因组序列间检测到48个SNP突变位点（表1），对检测到的48个SNP突变位点进行统计，发现没有SNP位于基因内含子区域，48个SNP位于CDS区域外显子上，没有SNP位于5’UTR和3’UTR（表1）。

2.3 基于谷子CYP450基因SNP位点160份谷子材料群体结构分析

群体结构分析将160份谷子材料划分为2个群，其中第一类群包含137个品种，主要来自中国河南省，中国河北省，中国内蒙古等地方，第二类群包含23个品种，主要来自中国辽宁省，中国陕西省等地方。（图5）

2.4 谷子CYP450基因SNP位点间的连锁不平衡分析

对谷子生长素应答蛋白基因的48个SNP位点来进行的连锁不平衡的结构分析，当R2=1时，有一组明显较大的连锁不平衡的结构，包括7个SNP位点，分别为SNP-3、SNP-8、SNP-12、SNP-13、SNP-14、SNP-18、SNP-35，这些基因位点都位在于编码区外显子中（图6，表2）。

2.5 谷子CYP450基因SNP位点与株高的关联分析

连续两年在洛阳地区测定了160份的谷子材料的株高，并用TASSEL软件的GLM和MLM两种模型对谷子CYP450基因与株高进行关联分析。2021年用GLM模型检测到谷子CYP450基因SNP位点与株高关联的位点有12个，分别为SNP-1、SNP-16、SNP-17、SNP-2、SNP-21、SNP-24、SNP-26、SNP-28、SNP-31、SNP-39、SNP-4、SNP-43，这些标记可解释的表型贡献率在0.03到0.05之间（表3）。

2022年用MLM模型在检测到谷子CYP450基因SNP位点与株高关联的位点有7个，分别是SNP-16、SNP-17、SNP-21、SNP-28、SNP-31、SNP-39、SNP-43，这些位点可解释的表型变异贡献率在0.03到0.05之间（表4）。

GLM模型和MLM模型共有的谷子CYP450基因SNP位点有7个，分别是SNP-16、SNP-17、SNP-21、SNP-28、SNP-31、SNP-39、SNP-43。在这7个谷子CYP450基因SNP位点3个为错义突变，分别是SNP-16氨基酸由Leu突变为Ile，SNP-17氨基酸由Leu突变为Val，SNP-28氨基酸由Gly突变为Ser，其余4个为无义突变（表5）。

3 讨论

3.1 CYP450基因株高关联位点的位置分析

GLM模型和MLM模型共有的谷子CYP450基因SNP位点有7个，分别是SNP-16、SNP-17、SNP-21、SNP-28、SNP-31、SNP-39、SNP-43。在这7个谷子CYP450基因SNP位点都位于编码区外显子中，其中3个SNP位点为错义突变，分别是SNP-16氨基酸由Leu突变为Ile，SNP-17氨基酸由Leu突变为Val，SNP-28氨基酸由Gly突变为Ser，其余4个为无义突变。姜达等[5]在对香稻的分析中指出外显子的突变是导致稻米变香的原因。葛生珍[6]研究水稻黄化中证明水稻外显子突变导致突变株发育不正常，不能进行光合作用，导致突变株死亡。李雯等[7]在研究谷子Si-SP1小穗突变基因中发现外显子的突变，导致了穗部变小，同时株高降低，根系变小等等表现型变异。本研究发现的和谷子株高有关联性的谷子CYP450基因SNP位点都稳定在编码区外显子区域，说明了CYP450基因应答蛋白基因的编码区外显子区域变异位点导致蛋白质结构发生改变使功能发生变化，从而对谷子株高有一定的调节作用。

3.2 CYP450基因功能

细胞色素P450（cytochromeP450，简称CYP450）代表着一个很大的可自身氧化的亚铁血红素蛋白家族，是单氧酶的一种，因其在450 μm有特异吸收峰因此命名为CYP450。根据氨基酸序列的同源程度，其成员又依次分为家族、亚家族和酶个体三级。1958 a，在肝细胞微粒体中发现了这些细胞色素。这个细胞色素家族的成员存在于进化道路上从细菌到人类的所有生物中。在原核生物中，CYP的功能是可塑性的，而在真核生物中，它们的功能是不同的。哺乳动物CYP是细胞膜的一个组成部分，参与许多生理活性物质的生物合成和代谢。它存在于除骨骼肌和成熟红细胞外的所有器官和组织中，参与催化生物转化[8]。

从功能意义上植物CYP450基因可以分为两大类型，一类是具有生物合成功能的CYP450基因，此类P450在木质素中间物、植物激素、萜类、黄酮类、等生物物质的合成中起重要作用;另一类为代谢解毒的CYP450基因，可以催化外源化合物如除草剂、农药等变成非毒性产物，它参与内源物质和外源物质的代谢，包括药物和环境化合物。在许多植物中发现细胞色素P450类蛋白对生育期生育期、株高有重要影响，对植物株型结构的形成有调控作用[9]。

4 结论

通过对160份谷子材料进行重测序，在CYP450基因内共检测到48个SNP位点，所有位点都位于编码区。基于SNP位点的群体结构分析将160份谷子材料划分为2个群，第一群包括137个品种，主要来自河南省、河北省、内蒙古等地方，第二群包括23个品种，主要来自辽宁省、陕西省等地方。对谷子生长素应答蛋白基因的48个SNP位点来进行的连锁不平衡的结构分析，当R2=1时，有一组明显较大的连锁不平衡的结构，包括7个SNP位点，分别为SNP-3、SNP-8、SNP-12、SNP-13、SNP-14、SNP-18、SNP-35，这些基因位点都位在于编码区外显子中。连续两年在洛阳地区测定了160份的谷子材料的株高，并用TASSEL软件的GLM和MLM两种模型对谷子CYP450基因与株高进行关联分析。用GLM模型检测到谷子CYP450基因SNP位点与株高关联的位点有12个，分别为SNP-1、SNP-16、SNP-17、SNP-2、SNP-21、SNP-24、SNP-26、SNP-28、SNP-31、SNP-39、 SNP-4、SNP-43。用MLM模型在检测到谷子CYP450基因SNP位点与株高关联的位点有7个，分别是SNP-16、SNP-17、SNP-21、SNP-28、SNP-31、SNP-39、SNP-43。GLM模型和MLM模型共有的谷子CYP450基因SNP位点有7个，分别是SNP-16、SNP-17、SNP-21、SNP-28、SNP-31、SNP-39、SNP-43。在这7个谷子CYP450基因SNP位点3个为错义突变，分别是SNP-16氨基酸由Leu突变为Ile，SNP-17氨基酸由Leu突变为Val，SNP-28氨基酸由Gly突变为Ser，其余4个为无义突变。

本研究初步证明谷子CYP450基因与株高有密切关联，为进一步研究CYP450基因对谷子株高的调控作用提供了有力的依据。

参考文献：

[1] 任巧萍.谷子化控间苗技术简介及栽培要点[J].农业技术与装备，2008（11）：37-38.

[2] 李晓宇，王昆鹏，张一波，等.谷子主要农艺性状分析[J].内蒙古农业大学学报，2015，36（2）：26-30.

[3] 汪思远，蒋世翠，王康宇，等.植物细胞色素P450的研究进展[J].吉林蔬菜，2014，31（4）：41-45.

[4] 余小林，曹家树，崔辉梅，等.植物细胞色素P450[J].中国细胞生物学学报，2004，26（6）：561-566.

[5] 姜达，卢小勇，王延春，等.27种香稻品种badh2突变位点序列的分析[J].分子植物育种，2015（2）：276-280.

[6] 葛生珍.水稻黄化突变体xnt7的生理特性和基因精细定位[D].重庆：西南大学，2014.6-15.

[7] 李雯，智慧，张硕，等.谷子Si-SP1小穗突变基因的遗传分析和定位[J].植物遗传资源学报，2015（3）：581-587.

[8] 解敏敏.烟草P450基因[J].中国烟草科学，2015（2）：118-120.

[9] 余小林，曹家树，崔辉梅，等.植物细胞色素P450[J].中国细胞生物学学报，2004，26（6）：561-566.

[10] 贾小平，张博，全建章，等.洛阳、吉林生态区谷子抗倒伏性的全基因组关联分析[J].浙江农业学报，2018，30（12）：1 981-1 991.

[11] 崔会婷，王珍，张铁军，等.蒺藜苜蓿MtCYP450基因的克隆及功能分析[J].中国草地学报，2018，40（5）：3-12.