长期不同施肥措施对盐碱地稻田土壤微生物数量和群落结构的影响

摘要：为阐明盐碱地稻田长期不同施肥对表层土壤微生物数量和群落结构的影响，以大安站盐碱地水稻长期定位施肥试验土壤为对象，采用磷脂脂肪酸（PIFA）分析法研究了单施氮肥（N）、无机肥配施（NPK）、有机肥单施（M）、有机肥与无机肥配施（MNPK）和秸秆还田配施无机肥（RNPK）对土壤微生物数量和群落结构的影响。结果表明：不同施肥处理土壤中共检测出57种PLFA生物标记，M、MNPK、RNPK和NPK处理的PLFA含量较N处理分别增加26.47%、29.76%、25.07%和13.20%，其中M、MNPK和RNPK处理显著高于N处理（P＜0.05）。MNPK处理土壤中的真菌／细菌的比值最大，较二者之比最小的M处理高6.00%，说明有机肥配施化肥对盐碱地稻田土壤生态系统的稳定性具有更好的改善作用。RNPK处理土壤中革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌之比最小，较二者之比最大的M处理降低了13.71%，说明秸秆还田配施化肥处理的土壤营养胁迫小，能有效改善土壤的营养状况。不同施肥处理微生物群落多样性大小表现为N处理土壤的Shannon-Wiener多样性指数（H）、Pielou均匀度指数（J）和Simpson优势度指数（D）最大，分别较3项指数最小的NPK处理增加10.91%、12.00%和13.79%。冗余分析结果表明，盐分电导率（EC）、有机质和pH对土壤微生物群落变化具有显著影响，解释量分别为54.8%、39.8%和33.1%。因此，长期有机肥与化肥配施、有机肥单施和秸秆还田配施无机肥能有效增加土壤微生物生物量并优化微生物群落结构，进而改善土壤生态环境。

关键词：苏打盐碱地；水稻；有机培肥；土壤微生物；磷脂脂肪酸（PIFA）；秸秆还田

中图分类号：S511；S154.3 文献标志码：A 文章编号：1672-2043（2024）08-1786-10 doi：10.11654/jaes.2023-0810

苏打盐碱土在我国东北松嫩平原西部广泛分布，仅吉林省西部面积就高达153万hm2。由于长期受干旱和半干旱气候控制，加之过度放牧和人类活动的影响，该区域土壤盐碱化加剧，植被退化严重。土壤盐碱化不仅对植物产生渗透胁迫和离子毒害，造成土壤养分的匮乏或不平衡，也在一定程度上影响了土壤微生物的数量和群落结构，导致土地生产功能和资源利用率下降。此外，苏打盐碱土碱性强，盐碱空间变异大，治理难度高，探寻科学合理的苏打盐碱地培肥措施对于提升土地生产力，改善土壤微生物群落结构，促进农田生态系统可持续发展具有重要意义。

长期以来，苏打盐碱土的治理措施主要包括土壤改良和植被修复，具体分为水利工程、农业耕作、化学改良及耐盐碱植物筛选等。这些治理措施的实质皆是降低盐碱危害或提高植物抗性。前人通过在苏打盐碱土治理中的不断实践，总结出“改土是前提，培肥是根本”的成功经验。近年来许多研究者在开展苏打盐碱土改良的同时，也愈加关注土壤培肥问题。培肥的核心在于提升土壤肥力，而微生物的数量等参数是评价土壤肥力的重要指标。因此，开展不同培肥措施对土壤微生物的影响研究有利于全面认识土壤培肥的科学意义，对于生产实践也具有重要的指导作用。

微生物在土壤中广泛参与各种养分的循环转化，它们的数量和群落结构通常可以有效反映土壤养分和能量循环的活跃程度，微生物对土壤物质组分、理化性质和微环境等具有高度的响应特性。由于盐碱土可溶性盐离子浓度高、水热条件差、可供微生物利用的C、N含量低等原因，其土壤微生物总量低于同生态区域的其他土壤，并且单一盐分土壤的微生物数量低于复合型盐分土壤。在农田生态系统中，土壤微生物的活跃程度常随着施肥处理的改变而改变，朱桃川等分析发现，长期增施有机肥的盐碱化土壤细菌群落多样性显著增加。也有研究指出，长期施用有机肥不仅可以促进微生物多样性的增加，还会刺激某些特定微生物群体的增殖，使其参与并加速复杂有机化合物的降解。郭振威等则报道了秸秆还田配施有机肥可显著改善土壤性质，增加土壤养分含量及微生物数量，从而达到优化土壤结构、提升土壤肥力的目的。

近年来，随着微生物研究的快速发展，微生物技术在盐碱土治理修复上也得到越来越多的应用。磷脂脂肪酸（PLFA）方法是一种常用的测定土壤微生物组成并定量的方法，是鉴定土壤中微生物的重要方法，虽有一定的局限性，但相较于耗时费力的平板微生物分离法、Biolog微平板法和价格高昂的16SrRNA方法，PLFA方法更加经济、快捷、准确。李新等利用PLFA谱图技术分析了河套平原的盐碱土微生物数量，发现微生物总量与土壤含盐量和碱化度呈显著负相关，且盐碱化程度越高，标记物多样性越单一，说明以盐碱为主导的土壤环境对微生物具有抑制作用。然而，盐碱土对微生物的抑制作用能否通过施肥措施得到缓解或改善，迄今还未见报道。为此，本研究以盐碱地水稻长期定位施肥试验土壤为研究对象，采用PLFA方法拟探究不同施肥处理对盐碱地稻田土壤微生物群落结构的影响，解析土壤盐分、养分与微生物的互作关系，阐明不同施肥措施对苏打盐碱地稻田土壤微生物菌群的影响，以期为苏打盐碱地稻田科学施肥技术的建立提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

本研究基于吉林大安农田生态系统国家野外科学观测研究站（简称大安站，45°35＇58＂-45°36＇28＂N，123°50＇27＂-123°51＇31＂E）的盐碱地水稻长期定位施肥试验进行。该站位于松嫩平原西部苏打盐碱土的典型分布区，土壤类型为苏打型草甸盐土或碱土，以及草甸盐碱化土壤。气候类型为温带大陆性季风气候，全年光照充足，无霜期130-140 d，全年日照时数平均在3 000 h以上，年平均气温4.3℃，年平均积温超过2 900℃，年均降雨量为350-400 mm。长期定位施肥试验开始于2010年，共设有11个不同施肥处理，每个处理设有4个重复，小区完全随机区组设计，面积为20 m2（5 m×4 m）。

1.2 试验设计

本研究土壤采自长期定位施肥试验的5个不同施肥处理，即单施氮肥处理（N）、无机肥配施处理（NPK）、有机肥单施处理（M）、有机肥与无机肥配施处理（MNPK）和秸秆还田配施无机肥处理（RNPK）。施肥处理的氮肥为尿素（含N 46.2％），施用量为N200 kg·hm-2；磷肥为普通过磷酸钙（含P2O5 16%），施用量为P2O5 100 kg·hm-2；钾肥为硫酸钾（含K2O50%），施用量为K2O 100 kg·hm-2。M处理肥料为当地腐熟羊粪，施用量为30 t·hm-2; MNPK处理无机肥用量占75%，有机肥用量占25%，折合腐熟羊粪用量为10 t·hm-2; RNPK处理的无机肥用量与NPK处理相同，秸秆还田量为10t·hm-2，基本为秸秆全量还田。

土壤样品采集于2022年6月水稻分蘖盛期进行，每个小区采集5点0-20 cm土壤混合样。取部分鲜土样放入-80℃冰箱内保存，样品冷冻一周内进行PLFA的测定；其余部分土样放置阴凉处风干后研磨过筛，用于测定土壤基本理化性质。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 土壤理化性质的测定

土壤pH值采用pH计（PHSJ-3F）测定，土壤电导率（EC）采用电导率仪（DDS-12DW）测定，土水比均为1：5。有机质含量采用重铬酸钾-硫酸外加热法测定，速效磷含量采用碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法测定，碱解氮含量采用碱解扩散法测定，Ca2+、Mg2+、Na+、K+、CO2-3、HCO3、Cl-和SO2-4含量采用常规方法测定。对于数据异常的样品进行反复多次测定，剔除异常值或以多次测定的平均值表示，具体测定方法参照《土壤农业化学分析方法》。

1.3.2 土壤微生物生物量的测定

用PLFA生物标记法测定土壤的微生物生物量，以甲酯19：0做内标，提取与分析方法参考文献，检测主要步骤为提取、分离、酯化和GC-MS分析，具体参照文献[28]进行。

1.4 微生物标记物的分类

微生物标记物的分类参考已公开发表的文献，具体分类结果总结列于表1。

1.5 微生物多样性指数计算

本研究通过计算Shannon_Wiener、Pielou均匀度和Simpson优势度对微生物多样性进行分析。

（1） Shannon-Wiener多样性指数（H）

H=-∑PilnPi

Pi=Ni/N

式中：Ni为处理i的特征PLFA的个数；N为该试验中总特征PLFA的个数。

（2）Pielou均匀度指数（J）

J=-∑Piln Pi/ln S

式中：S为微生物群落中PLFA生物标记出现的频次，即丰富度。

（3）Simpson优势度指数（D）

D=1-∑Pi2

1.6 数据处理

数据处理采用Excel软件，方差分析（ANOVA）采用SPSS软件，相关性分析和热图绘制采用Origin2021，冗余分析（RDA）采用R（4.1.1）软件。图表中数据为平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 土壤基本理化性质

不同施肥处理的土壤基本理化性质具有一定的差异（表2）。在5个施肥处理中，仅MNPK处理的土壤pH显著低于NPK和RNPK处理（P＜0．05），其余4个施肥处理的土壤pH差异不显著；N处理的EC显著低于MNPK处理（P＜0．05），其余4个施肥处理的电导率差异不显著。NPK处理土壤有机质含量显著低于M和MNPK处理（P＜0．05），M处理土壤碱解氮和速效磷含量显著高于N、NPK和MNPK处理（P＜0．05），以土壤速效磷含量为例，NPK、M、MNPK和RNPK处理的速效磷含量分别较N处理增加2.59、5.79、3.01倍和3.20倍。

2.2 土壤微生物PLFA含量

在所有施肥处理中总共检测到了57种PLFA生物标记（表3）。在N、NPK、M、MNPK及RNPK中分别发现了52、50、50、51种和55种PLFA生物标记，总含量分别为（116.72±12.03）、（132.13±12.75）、（147.61±11.98）、（151.45±24.75） nmol·g-1和（145.98 ±19.36）nmol·g-1，N处理的总含量显著低于M、MNPK和RNPK处理。RNPK处理土壤中PLFA生物标记种类最多，MNPK处理土壤中PLFA生物标记总含量最高。所有处理中，完全分布的PLFA生物标记有48种，不完全分布的PLFA生物标记有9种。在57种标记中，有显著差异的共18种，其中MNPK处理和N处理之间存在15种具有显著差异的标记，占83.33%。

2.3 土壤特征微生物类群PLFA含量

土壤微生物中细菌的PLFA含量最高，其次是真菌和放线菌（图1）。MNPK处理的细菌含量最多[（121.18±17.50）nmol·g-1]，分别较M、RNPK、NPK和N处理增加3.25%、5.15%、16.00%和32.84%，在5个施肥处理中，仅MNPK处理细菌含量显著高于N处理，其余4个处理细菌含量与N处理无显著差异。MNPK处理的真菌含量最多[（16.60±2.37）nmol.g-1]，分别较RNPK、M、NPK和N处理增加6.07%、9.28%、19.86%和39.38%，MNPK处理土壤真菌含量显著高于N处理，其他处理之间差异不显著。放线菌含量在5个施肥处理间没有显著差异，真菌和细菌的PLFA含量比值（真菌／细菌）表现为MNPK＞RNPK＞NPK＞N＞M。

革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）之间PLFA含量有明显差异（图2）。革兰氏阳性菌含量最多的M处理[（34.64±0.59）nmol·g-1]较含量最少的N处理增加0.32倍，M和MNPK处理革兰氏阳性菌含量显著高于N和NPK处理（P＜0.05）。革兰氏阴性菌含量最多的RNPK处理较最少的N处理增加了0.30倍，5个处理之间，革兰氏阴性菌含量无显著差异（P＞0．05）。革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌之比（G+/G-）表现为M＞MNPK＞N＞NPK＞RNPK。

2.4 土壤微生物群落多样性指数

微生物群落多样性指数在不同施肥处理中没有显著性差异（表4）。N处理的H／指数、J指数和D指数均最大，其中H指数较M、MNPK、RNPK和NPK处理分别增加1.67%、3.39%、5.11%和10.91%，J指数较M、MNPK、RNPK和NPK处理分别增加1.82%、3.70%、5.66%和12.00%，D指数较M、MNPK、RNPK和NPK处理分别增加3.12%、6.45%、10.00%和13.79%，表明不同施肥处理间土壤微生物群落的3种多样性指数具有相同的变化趋势。

2.5 土壤微生物数量、群落结构与土壤理化性质的关系

为进一步了解土壤环境因子对微生物群落的影响，将土壤环境因子与微生物群落进行RDA分析（图3），结果表明微生物群落与土壤环境因子指标生物RDA分析中前两个排序轴总共解释了群落变化的8 3.62%，其中第一排序轴解释了55.16%，第二排序轴解释了28.46%。土壤环境因子对土壤微生物群落变化影响大小顺序为EC（r2=0.548）＞土壤有机质（r2=0.398）＞pH（r2=0.331）＞Na+（r2=0.293）＞HCO-3（r2=0.277）＞K+（r2=0.205）＞SO2-4（r2=0.186）＞Cl-（r2=0.138）＞速效磷（r2=0.070）＞Ca2++ Mg2+（r2=0.051）＞CO2-3（r2=0.047）＞碱解氮（r2=0.036）。其中，对土壤微生物群落变化具有显著影响的因子有EC、土壤有机质和pH，解释量分别为54.8%、39.8%和33.1%。由此可见，EC、土壤有机质和pH是影响长期不同施肥盐碱地稻田土壤微生物群落结构的主要环境因子。

3 讨论

3.1 土壤微生物数量和种类对不同施肥措施的响应

通常，土壤微生物数量是评价土壤肥力的重要指标之一。M、MNPK及RNPK处理较N处理显著增加了土壤微生物生物量。本研究显示，M、MNPK和RNPK处理的有机质含量较NPK处理分别增加15.46％、14.23%和4.86％。也有研究指出，施肥可增加土壤的微生物生物量，有机肥配施无机肥可增加稻田根际土壤的微生物生物量，对河套灌区盐渍化土壤微生物群落研究表明增施有机肥和秸秆还田能够改善土壤微环境，显著增加土壤微生物生物量。本研究结果与上述研究基本一致，其原因可能是有机肥或秸秆还田为盐碱化土壤输入了大量的有机物料，增加了土壤微生物宿主的数量，为微生物提供碳源，进而促进微生物生长。

土壤微生物群落组成及多样性既体现了土壤的生态胁迫，也反映着土壤的生物活性。本研究运用PLFA法定量研究了盐碱地稻田不同施肥处理下土壤微生物群落结构及多样性。研究结果发现，所有处理中共检测出57种PLFA生物标记，其中RNPK处理中PLFA生物标记的种类最多。有研究报道的秸秆配施氮肥土壤微生物群落中检测到33种PLFA标记，也有研究指出，在秸秆、有机肥和无机肥的共同施用下的土壤微生物群落中仅检测到30种PLFA标记。因此不能简单地用土壤PLFA种类的多少来判断施肥方式的好坏，不同土壤微生物对环境的敏感性存在差异。

3.2 土壤微生物多样性与群落结构对不同施肥措施的响应

土壤微生物多样性特征目前广泛采用Shannon-Wiener多样性指数、Pielou均匀度指数和Simpson优势度指数表示。本研究发现，盐碱地稻田长期不同施肥的土壤微生物多样性指数无显著差异。有研究指出，长期外源养分（特别是氮素）添加会降低土壤微生物的多样性，也有研究在Cedar Creek长期氮添加实验和Nutrient Network联网实验中得出施氮对土壤微生物多样性的影响并不显著的结论。前者认为长期氮素添加导致土壤微生物多样性降低主要是基于施氮引发了土壤酸化，后者认为并未产生显著影响的原因是由于施氮对土壤的pH未产生显著的影响。本研究结果与后者研究结果相近，N处理的各项多样性指数虽高，但与其他处理并无显著差异（表4），同时N处理pH与其他处理也无显著差异（表2）。造成本研究结果与前者不相同的原因可能是由于本研究选用的苏打盐碱土为一类特殊土壤，其具有高pH和高碱化度的特征，盐碱地稻田长期施用氮肥具有增加稻谷产量和改良土壤的双重功效。此外，本研究检测方法的限制也可能是造成这种差异的原因。总之，对于N处理具有较高的多样性指数的深层原因还有待进一步研究。

真菌／细菌能够反映出土壤微生物群落结构的稳定性，比值越高则生态系统越稳定。有研究报道，施用有机肥能够有效改善土壤理化性质，提高土壤肥力，并且为土壤细菌提供良好的生长环境。研究结果显示MNPK处理的真菌／细菌最大，说明该施肥处理对于盐碱地稻田土壤生态系统的稳定性具有更好的改善作用。在土壤细菌群落中，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌是两大主要类群，G+/G-与土壤肥力具有紧密联系，比值越高预示着营养胁迫程度越大。本研究发现RNPK处理土壤中G+/G-最小，表明该土壤营养胁迫小，长期秸秆还田能有效改善土壤的营养状况，从而提高土壤中微生物生物量。邬奇峰等的研究表明，长期秸秆还田可改变其群落结构并能够显著提高土壤的微生物生物量，这可能是由于秸秆还田可以提高土壤有机质的矿化率，有机质矿化过程又可以为微生物提供能量。

3.3 土壤微生物与盐分、养分之间的关系

通常土壤微生物数量和多样性与地表的植被类型、土壤含水量、土壤pH、有机质含量及养分含量等理化性质密切相关。本研究发现，土壤EC、有机质含量和pH是影响盐碱地稻田土壤微生物群落结构的主要环境因子。土壤有机质是土壤中大多数微生物的主要能量来源，它的含量是决定土壤微生物多样性和群落结构的重要因素。牛世全等研究发现河西走廊地区盐碱化土壤微生物群落结构与pH和EC显著相关。不同盐碱程度对土壤微生物群落结构有重要影响，随着土壤盐分增加，土壤结构松散程度逐渐变大，稳定性降低，从而影响土壤微生物的生存。前期研究发现，土壤pH和EC是表征苏打盐碱土盐碱化程度的重要参数，其数值与土壤各盐分离子含量等指标具有显著的相关性。在苏打盐碱土改良实践中常用土壤pH和EC的下降程度来判定土壤改良效果。本研究结果表明，土壤微生物数量和群落结构变化直接反映着土壤盐碱程度和有机质含量的变化（图3），因此可作为验证盐碱土改良效果的重要指标。

4 结论

长期有机肥与化肥配施、有机肥单施和秸秆还田配施无机肥处理的土壤微生物磷脂脂肪酸含量最高，三者比较而言，长期有机肥与化肥配施对盐碱地稻田土壤生态系统的稳定性具有更好的改善作用，秸秆还田配施无机肥对盐碱地稻田土壤营养状况具有更好的改善作用。苏打盐碱土的电导率、有机质含量和土壤pH是影响微生物群落结构的主要环境因子。长期有机肥与化肥配施、有机肥单施和秸秆还田配施无机肥均能有效增加土壤微生物生物量并优化微生物群落结构，进而改善土壤生态环境。

（责任编辑：李丹）

基金项目：吉林省科技发展创新创业卓越人才（团队）项目（20220508IIORC）；国家自然科学基金面上项目（41977148）；中国科学院黑土地保护与利用科技创新工程专项（XDA28110103）