灵芝育种技术应用研究进展

关键词：灵芝；育种技术；品种改良；食用菌；药食同源真菌

0 引言

灵芝又称神芝、仙草、瑞草，广义上指灵芝科（Ganodermataceae）的所有种类，狭义上指被《中华人民共和国药典》收录、作为法定中药材的赤芝（Ganodermalucidum）或紫芝（G.sinense）干燥子实体，是一类大型的药食同源真菌，被纳入按照传统既是食品又是中药材的物质目录[1-2]。灵芝富含多糖、三萜、甾醇等多种活性物质，具有抗肿瘤、抗病毒、降血压、保肝护肝、抗氧化和调节免疫等多种功效，已被广泛应用于功能性食品、保健食品和药品等产业[3-8]。

随着健康中国战略的深入实施，我国大健康产业进入高质量发展阶段，人们对大健康产品的需求越来越强烈，素有仙草之称的灵芝更是受到大众青睐[9]。为满足市场的需求，近年来，灵芝栽培规模逐年扩大，精深加工产品涉及食品、医药、保健和护肤等领域，产品附加值不断提升，对灵芝的品质、产量等提出了更高的要求[10-12]。因此，通过创造遗传变异来改良灵芝品种，培育出品质优、产量高、抗逆性强、适应性广、易管理且遗传稳定的优良新品种，是保障灵芝产业持续健康发展的重要基础。目前，应用于灵芝的主要育种方法有人工驯化栽培、人工选择育种、诱变育种、杂交育种、细胞工程育种及基因工程育种等。

1 人工驯化栽培

XoFVv1PTwBn30IP8QH6IiXuvCkH/K63KfImIeuupu+4=灵芝人工驯化栽培是指将采集的野生灵芝，通过组织分离或孢子分离获得菌株，再经过人工栽培适应性驯化，由野外自然生长改为人工栽培的方法。20世纪60年代，我国首先将野生灵芝驯化栽培成功[13]。通过人工驯化栽培本地野生灵芝，既便于成功驯化，又可保护野生灵芝资源种群和生物遗传多样性。

王德芝等[14]通过对位于信阳市南部楚豫交界处，属大别山脉和桐柏山脉交汇间的鸡公山地域的野生灵芝进行驯化育种探索，对比试验观察发现，鸡公山野生灵芝-1号菌种与泰山赤芝在形态色泽方面有差别，在营养和环境条件方面差别不大，显示灵芝物种的多样性，为灵芝杂交育种提供基因库资源。何俊等[15]对采自云南省楚雄彝族自治州的滇中灵芝和采自云南省文山州的可食灵芝开展生物学特性研究并驯化，研究发现，两个菌株子实体总三萜和多糖含量均高于《中华人民共和国药典》（2020年版）要求，并通过开袋覆土栽培方法，首次成功驯化滇中灵芝和可食灵芝，为灵芝育种研究提供了新的种质资源。

2 人工选择育种

灵芝人工选择育种是指通过组织分离、菌种筛选、纯化复壮，筛选出优良灵芝菌株，再经过人工栽培试验获得产量高、抗性强、营养丰富灵芝品种的方法。人工选择育种需要在有大量亲本的基础上，经过一代一代的定向选择培育，将优良性状不断扩大，耗时长，突变率低，是各育种方法的基础。

贺黎铭等[16]采用系统选育法，从野生灵芝菌株中选育出综合性状优良的灵芝菌株药赤芝1号，并对其进行连续2年的多点品比试验，试验发现，该菌株具有遗传性状稳定、适应性强、生产周期较短、产量高和内在品质优的特点，并且浸出物、多糖、三萜及甾醇含量关键指标均显著高于对照。唐明先等[17]通过采集野生藏灵芝，结合系统选育，将分离、纯化的菌株进行出芝筛选试验，筛选出出芝整齐、农艺性状稳定且遗传稳定性高的优良菌株，经鉴定该菌株为白肉灵芝，功能成分含量较高，是灵芝新菌株。

3 诱变育种

灵芝诱变育种是指利用物理或化学因素诱导灵芝发生基因突变，产生遗传变异，然后筛选出有利的变异体并保存育种。但是，并非所有基因突变都会朝着有利突变，更多的会是朝负向突变，因此需要花费更多的时间和精力从所有突变体中筛选出有利的突变菌株[18]。

近年来，原生质体技术已广泛应用于食用菌的研究，由于原生质体没有细胞壁的障碍，常作为诱变育种的良好材料，可大大提升灵芝的突变效率[19]。

3.1 物理诱变

常见的物理诱变包括紫外线诱变、等离子体诱变、航天诱变等。刘月芹等[20]采用紫外灯照射灵芝原生质体的诱变方式，经过多次筛选与纯化，筛选出能在37°C高温下生长的灵芝新菌株，为灵芝的基础研究及其他耐高温菌种的选育提供了一定的参考。李塬等[21]利用常压室温等离子体对灵芝菌株的原生质体进行诱变处理，经过继代培养、拮抗试验和RAPD分子标记分析，从众多诱变菌株中筛选出高产多糖且遗传稳定性良好的新菌株。

随着航天技术的快速发展，利用太空特殊环境诱变种子发生变异的育种方式不断运用于农业微生物产业中[22-23]。王雪婷等[24]从搭载长征五号B运载火箭进入太空进行诱变处理的一号灵芝中分离纯化得到7株诱变菌株，并对出发菌株和诱变菌株进行拮抗试验、形态学特征观察、出菇试验、分子生物学鉴定、同源性分析及菌株菌丝体液体发酵产总三萜的能力测试，最终获得1株原种菌丝生长速度较快，并且具有高产总三萜能力的诱变菌株。

3.2 化学诱变

常见的化学诱变主要有氯化锂、甲基磺酸乙酯（EMS）[25]、亚硝酸诱变。氯化锂作为一种高效、低毒的化学诱变剂，经常被用作诱变育种。董玉玮等[26]采用化学诱变剂氯化锂诱变赤灵芝原生质体，筛选出高产三萜类的菌株，经继代培养，发现诱变菌株遗传性状稳定性良好。QUANLY等[27]采用浓度0.1mol/L的亚硝酸作为化学诱变剂，对灵芝菌丝体进行诱变处理5min，获得比原菌丝生长能力更强的菌株。

3.3 复合诱变

近年来，越来越多研究人员采用物理诱变与物理诱变、化学诱变与物理诱变相结合的方式进行复合诱变，提高正突变率[28]。李塬[29]利用紫外和ARTP诱变技术，对出发菌株的原生质体进行诱变处理，获得高多糖的诱变菌株。刘晓丹等[30]利用紫外线和硫酸二乙酯逐级诱变处理1株产漆酶树舌灵芝的菌丝片段，最终诱变获得1株遗传稳定的高产漆酶突变菌株，与原始菌株相比，漆酶活性提高63.3％，同时发酵周期缩短1d。

4 杂交育种

灵芝杂交育种是指以两个或多个不同基因型的灵芝菌株作为亲本，通过担孢子杂交将亲本基因结合，从而获得兼具双亲优势并能稳定遗传的新菌株。灵芝的交配系统为四极性异宗结合，同核体种间交配不相容，自交不孕，杂交可孕[31]。杂交育种的关键是对优势亲本进行筛选，通常将野生菌株与地方栽培品种作为来源不同的亲本，杂交培育出更多适合当地栽培的优良灵芝菌株[32-33]。通过在人工条件下诱发灵芝孢子萌发，再从中筛选出杂交育种所需的单核菌株，该方法育种时间较长，工作量大，育种过程比较复杂，不易操作[34-35]。近年来，越来越多研究人员采用原生质体单核化技术将双核灵芝菌株单核化，用作杂交育种的亲本材料[36]。灵芝杂交育种中常见的方式为单孢杂交和双单杂交。

4.1 单孢杂交

单孢杂交是指将可亲和的两株不同遗传背景的单核体作为亲本进行杂交的方式。LIUS等[37]从两个商业品种灵芝JC和AL菌株的担孢子中各成功分离获得19个和12个单核体，两个菌株的228个（19×12）单核体杂交中，有83个成功（性相容）从中分离出68个杂交种，选择32个菌丝长势较好的杂交种培养成子实体，最终筛选出1株多糖（16.63mg/g干质量）和三萜含量均高（10.50mg/g干质量）的杂交菌株H-23。吴芳等[38]以赤芝与中华灵芝为亲本，将从两个亲本的担孢子中分离的单核体进行杂交，得到39个杂交菌株，通过筛选获得生物学特性与产量较优的两个杂交菌株GH07和GH09，均具有菌柄较短、正品率高、生物转化率高和产孢量高等特点，成功选育了赤芝与中华灵芝的杂交菌株。丛倩倩等[39]以国家认定品种泰山赤灵芝1号（TL-1）和野生灵芝菌株4895为亲本，通过原生质体单核化杂交育种技术选育出一株比亲本TL-1具有更大优势的灵芝新品种TL-3，其平均单产提高12.23％、生物学效率提高12.37％，子实体多糖和三萜含量分别提高1.87％和37.5％。

4.2 双单杂交

双单杂交是指将一株单核菌丝和另一株双核菌丝作为亲本进行杂交的方式，又称单核体×双核体杂交育种。双单杂交与单单杂交在亲本的选择上虽然不同，但两者杂交本质均为单单杂交[33]。仇昊等[40]以赤芝和白肉灵芝（G.leucocontextum）为亲本，采用亮盖灵芝异核体双核菌丝与通过原生质体单核化获得的白肉灵芝单核体进行双单杂交，最终获得34株杂交子；采用ISSR技术对34株杂交子及亲本进行DNA多态性聚类分析，杂交子主要分为两个类群；对杂交子进行生长速度和灵芝酸含量对比，筛选到4株优质杂交子；继而进行杂交子及亲本间HPLC指纹图谱对比，发现4株杂交子中有3株HPLC指纹图谱在具备两个亲本特征灵芝酸的同时，还有低极性灵芝酸的产生。

5 细胞工程育种

灵芝细胞工程育种是指将两个或多个来源不同的灵芝原生质体，采用自发融合或者人工诱导融合，克服细胞不亲和的障碍，获得具有重组基因的优势杂种菌株。常见的人工诱导方法有物理诱导融合和化学诱导融合。

5.1 物理诱导融合

常见的物理诱导融合方法主要是电融合法。高明侠等[41]采用灵芝原生质体电融合技术选育高产多糖菌株，通过电融合方法对紫芝和赤芝原生质体电融合条件进行了研究，表明灵芝原生质体电融合的最佳条件为脉冲强度10kV、脉冲间隙24μs、脉冲次数3次/s，最高融合率0.038%。发酵结果显示，选育的融合菌株GL-18的生物量和多糖含量均高于亲本菌株。陈合等[42]通过电融合法对白芝（Ganodermaapplanatum）和赤芝原生质体融合条件进行了研究，表明灵芝原生质体电融合的最佳条件为交变电流频率2MHz、电压40V、直流脉冲脉幅10kV/cm、脉宽25μs及直流电压500V，融合率可达40%。

5.2 化学诱导融合

化学诱导融合方法中常用的融合剂主要有聚乙二醇（PEG）、甲基磺酸乙酯（EMS）。陈小红等[43]以茯苓和灵芝为亲本菌株，PEG作为原生质体融合剂，研究茯苓与灵芝原生质体的融合育种条件和构建茯苓育种的漆酶转化体系，研究发现，原生质体融合的最佳条件为25%PEG4000、pH值8.5、35°C和20min，筛选获得了具有茯苓遗传性状、与灵芝的亲缘关系较远但具备部分灵芝遗传性状的稳定融合菌株，并且测定表明亲本灵芝的产漆酶性状转移到了融合菌株中。马欣燕[44]采用原生质体融合育种技术，对印度块菌和赤芝的原生质体制备、再生及融合条件进行了研究，其最佳融合条件为30%PEG6000、40mmol/LCa2+、30°C和pH值8.0融合25min，融合率达8.43×10−7；经菌落表型、菌丝形态、菌丝生长速度的对比及结合RAPD、ERIC分子标记等方法进行鉴定，两融合子是亲本的融合产物，融合子Ra与印度块菌亲缘关系最近，融合子Rb则与赤芝的亲缘关系更近。

6 基因工程育种

灵芝基因工程育种是指将特定的基因片段通过载体导入到灵芝细胞内，经过复制、表达，获得具有特定遗传性状的灵芝新品种。CRISPR/Cas9具有介导高效、高精度基因组修饰的能力，是分子育种的有力工具，已成功应用于多种食用菌，不仅比传统育种方法更方便，而且效率更高[45-46]。利用基因工程育种，不仅可以提高灵芝中多糖、灵芝酸等含量，还可以将肿瘤坏死因子、自介素-2等基因导入灵芝中并使之高效表达，以进一步提高灵芝的免疫调节和抗肿瘤方面的功效[47]。

秦浩[48]首次在灵芝中建立了CRISPR/Cas9基因组编辑系统，使得灵芝ura3基因产生双链断裂，并诱导两株灵芝菌株中产生了ura3中断菌株，同现有应用的基因中断技术相比，具有操作便捷、适用性强等优点，可以在通过传统的同源重组方法无法实现的菌株中进行基因中断。TANY等[49]利用灵芝栽培品种沪农灵芝1号的单核菌株L1构建并优化了一种RNP介导的灵芝菌株CRISPR/Cas9基因组编辑系统，揭示了核酸内切酶Cas9诱导修复DNA双链断裂的特性：大部分通过非同源末端连接修复，少部分通过微同源末端连接修复，并利用该系统编辑了两个灵芝菌株基因cyp512a3和cyp5359n1，对灵芝的定向育种和合成代谢调控具有重要意义。WANGPA等[50]在灵芝中构建了三萜类灵芝酸生物合成功能基因的CRISPR/Cas9基因组编辑系统，建立的系统用于细胞色素P450基因cyp515018，测序确认获得了精确编辑的cyp515018突变体，并对野生型（WT）和突变体的发酵产物进行了分析，发现与WT相比，突变体中鉴定的4种三萜类灵芝酸的浓度显著降低；利用已建立的基于CRISPRCas9的G.lucidum基因编辑平台，22，23-角鲨烯二氧化素cyp505d13也被破坏，为灵芝菌种分子选育及其他担子菌菌种的生物技术应用提供参考。

7 结束语

目前，灵芝育种技术不断改进，育种方法多样。传统的灵芝育种技术如驯化栽培、人工选育、诱变育种和杂交育种，虽然方法简单，但获得的正向突变菌株少，需要筛选大量菌株，耗时长、效率低。随着生物技术的发展，越来越多研究人员将新技术与传统育种方法相结合，采用多种育种方法交叉结合，将分子标记、基因编辑等技术应用在灵芝育种中，实现靶向育种，大大提高了目标菌株的育种效率，但因其技术难度大，体系尚不成熟。尽管灵芝育种方法日趋丰富，育种环节仍然是整个产业链的薄弱环节，灵芝生理代谢机制研究不够深入、品种分类不清晰和命名较乱、缺乏新品种审定机制和平台、育种知识产权保护不足等问题制约着灵芝种业发展。

未来灵芝市场对灵芝品种的选育基于农艺性状、栽培繁育等方面，其具有的药用活性成分如多糖、三萜等含量逐渐成为选育的重要方向。要建立成熟的灵芝育种体系，保障灵芝产业高质量发展，需着力加强如下3方面工作。一是要持续加强育种技术的研究。改良传统育种方法，将新型物理、化学、生物技术与传统育种方法相结合，建立高通量筛选方法，提高育种效率。二是拓展灵芝研究领域，如灵芝生长机制及遗传特性的基础研究、影响农艺性状的分子机制研究、灵芝栽培品种分类等方面的研究，提高育种精准度。三是完善灵芝新品种保护和品种审定、登记等管理制度，引导灵芝育种市场化、产业化、规范化和高质化发展。