黄梁木叶精油对柱花草和水稻秸秆发酵品质及细菌群落的影响

收稿日期：2024-05-28；修回日期：2024-07-03

基金项目：广东长隆慈善基金会（CLPF2021007Z）;国家自然科学基金项目（31771345）；广东省林业科技创新项目（2019KJCX001）资助

作者简介：周雨歆（2000-），女，汉族，江西南昌人，硕士研究生，主要从事牧草青贮加工研究，E-mail：Deodatus@163.com;*通信作者Author for correspondence，E-mail：zqing1988@126.com

摘要：为探究黄梁木（Neolamarckia cadamba）叶精油分别对柱花草（Stylosanthes guianensis L.）和水稻（Oryza sativa L.）秸秆青贮发酵品质和细菌群落结构的影响，本试验基于新鲜柱花草和水稻秸秆重量的0.5%和1%添加黄梁木叶精油（NCEO）进行青贮混合处理，每个处理3组重复，装入聚乙烯密封袋并用真空封口机密封，青贮30 d后测定样品的青贮发酵品质指标，分析细菌群落结构。结果表明：添加黄梁木叶精油显著降低了柱花草和水稻秸秆青贮饲料中pH值、氨态氮含量、乳酸菌和大肠菌群数量（P＜0.05），显著提高了水稻秸秆青贮饲料的乳酸和真蛋白含量（P＜0.05）。乳酸菌在水稻秸秆青贮饲料中占优势地位，且数量随黄梁木叶精油添加量的增加而升高。黄梁木叶精油的添加也增加了异根瘤菌属、甲基杆菌属和黄单胞杆菌属的相对丰度。综上所述，添加1%黄梁木叶精油可有效改善柱花草和水稻秸秆青贮发酵品质。

关键词：黄梁木叶精油；青贮品质；细菌群落；柱花草；水稻秸秆

中图分类号S816.5+3 文献标识码：A 文章编号：1007-0435（2024）10-3326-09

Effect of Neolamarckia cadamba Leaf Essential Oil on Fermentation Quality and Bacterial Community of Stylo and Rice Straw Silage

ZHOU Yu-xin， YANG Dan， YANG Wei-tao， CHEN Dan-dan， CHEN Xiao-yang， ZHANG Qing^*

（College of Forestry and Landscape Architecture， South China Agricultural University， Guangzhou， Guangdong Province 510642， China）

Abstract：The objective of this experiment was to explore the effect of Neolamarkia cadamba leaf essential oil （NCEO） on the fermentation quality and bacterial community of stylo （Stylosanthes guianensis L.）and rice（Oryza sativa L.）straw silage. Based on the weight of fresh stylo and rice straw，adding the 0.5% and 1% NCEO into materials for 30 days ensiling. Vacuumed and sealed after three replicates of each treatment were packed into plastic bags （20 cm×30 cm）. After 30 days of ensiling，the chemical composition and silage indexes of the samples were evaluated statistically. The results of fermentation parameter，protein fraction and bacterial community indicated that NCEO addition decreased （P<0.05） pH value，ammonia-N content，and numbers of lactic acid bacteria and coliform bacteria both in stylo and rice straw silage. And lactic acid content and true protein proportion of rice straw silage increased （P<0.05） with NCEO addition. Lactobacillus was the most dominant genus and increased with NCEO addition in rice straw silage. The NCEO addition also increased the relative abundance of Allorhizobium，Methylobacterium and Xanthomonas. In conclusion，the 1% NCEO addition was an effective way to improve the fermentation of stylo and rice straw silage.

Key words：Neolamarckia cadamba leaf essential oil；Fermentation quality；Bacterial community；Stylo；Rice straw

柱花草（Stylosanthes guianensis L.）是一种重要的豆科灌木，其年产量高且营养价值丰富，广泛种植于热带和亚热带地区^［1］，蛋白含量高，适口性好^［2］，常被用作牛、山羊和绵羊的饲料^［3］。在我国农业生产过程中，水稻（Oryza sativa L.）秸秆属于一种农业废弃物，一般情况下，这些秸秆废弃物多在田间直接焚烧处理，导致甲烷和二氧化氮等温室气体大量排放^［4］。同时，水稻秸秆结构复杂，难以利用化学和生物方法对其进行降解^［5］。青贮是将收获的牧草长期有效贮存的一种常用手段，操作简便、成本低廉且营养损失较少^［6］，但由于青贮过程中常存在发酵底物不足、不良微生物数量过多等不利情况，通常难以获得优质青贮饲料^［7］。研究表明，因水溶性碳水化合物含量低且缓冲能值高，柱花草材料难以青贮成功^［8］，水稻秸秆青贮过程中也存在相似问题^［9］。饲料青贮过程中的pH值常无法迅速降低，同时梭状芽孢杆菌和肠杆菌等不良微生物的存在使青贮过程中丁酸大量产生，蛋白质被部分水解，导致青贮结果较差。为有效改善柱花草与水稻秸秆的青贮品质，提高其营养价值，在青贮过程加入饲料添加剂，可减少青贮的不利因素，提高青贮质量^［10］。

精油是植物中挥发性和疏水性物质的混合物，具有良好的抗菌作用和较高的抗氧化生物活性^［11］，广泛应用于制药和化妆品行业，也可应用于畜牧业^［12］。黄梁木（Neolamarckia cadamba）是一种生长速度快的半落叶树木，树叶高产，具有高营养价值和高抗菌能力，可作为合适的饲料资源^［13］。研究发现，在柱花草青贮中添加黄梁木叶，可以通过降低pH值、氨态氮含量，提高乳杆nyYbqErdHzhoqvLqGbM2LA==菌丰度以改善青贮发酵品质^［14］。因植物精油有抑菌消炎与防止饲料霉变等作用，其常被应用于畜牧生产中，然而，鲜有学者研究关注添加黄梁木叶精油对青贮发酵品质的影响。

因此，该试验假设黄梁木叶精油可以通过改变细菌多样性来改善青贮品质，分别添加0.5%和1%浓度的黄梁木叶精油对新鲜柱花草和水稻秸秆进行青贮，在发酵30 d后分析检测发酵特性，蛋白组分和细菌群落。

1 材料与方法

1.1 试验设计

柱花草，水稻秸秆和黄梁木叶均采集于中国广东省广州市华南农业大学启林北试验田（23 °19 ′N，113 °34 ′E）。柱花草全株未施用除草剂和化肥，经栽培两年后在现蕾期收获，水稻秸秆在穗期后收获，留茬5 cm人工收割。用铡刀将试验材料切割成2 cm左右的小段，将2种材料分别混合均匀后各取3份进行化学组分和微生物群落分析。以1∶2的料液比将新鲜黄梁木叶和纯水充分混合，蒸馏3 h后得到黄梁木叶精油，精油提取率为0.3%（W/V），4℃保存备用。本试验基于新鲜柱花草和水稻秸秆重量的0.5%和1%添加黄梁木叶精油进行青贮混合处理，并以不添加精油作为对照组。处理后将混匀的青贮材料分别装入聚乙烯塑料包装袋（20 cm×30 cm）中，用真空封口机（广东省东莞市益健机械包装有限公司）进行真空密封。将18个青贮袋（2种材料×3个处理×3个重复）放置在室温（25℃～30℃）的房间中储存，青贮30 d后取样分析发酵参数和化学成分。

1.2 微生物及化学指标的测定

各取3份柱花草和水稻秸秆青贮样品，进行发酵参数分析^［7］，分别取20 g青贮样品，加入180 mL生理盐水，置于恒温摇床中（37℃，180 r·min^-1）混合均匀，逐级稀释上清液，从10^-1稀释到10^-6。将稀释液接种到MRS琼脂培养基、结晶紫中性红胆盐琼脂培养基和孟加拉红定性培养基中，用平板计数法测定乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）、酵母菌、霉菌及大肠菌群的数量。

另取20 g青贮样品加入180 mL纯水，置于4℃冰箱中放置24 h后，用定性滤纸过滤，测定pH、有机酸和氨态氮（Ammonium nitrogen，NH-N）。pH值用pH计（雷磁PHS-3C型pH计，上海精密科学仪器有限公司）测定，氨态氮用苯酚-次氯酸钠比色法测定^［15］。使用高效液相色谱（KC-811column，Shodex，Shimadzu，日本；柱温50℃；流速1 mL·min^-1；波长210 nm；SPD-M10AVP检测器；高氯酸流动相3 mmol·L^-1，进样量5 μL）对包括乳酸、乙酸、丙酸和丁酸在内的有机酸含量进行测定^［16］。

剩余各处理的60 g青贮样品经烘箱烘干后计算干物质（Dry matter，DM）的量，磨碎后分析其化学成分。蛋白质组分包括粗蛋白（Crude protein，CP）和真蛋白（True protein，TP），使用凯氏定氮仪（FOSS全自动凯氏定氮仪KJELTEC 2300，瑞典）进行检测^［17］。使用15%（W/V）的三氯乙酸对烘干后的青贮样品处理1 h，烘干后对真蛋白含量进行分析。非蛋白氮含量为粗蛋白与真蛋白的差值。依照范式纤维素测定法^［18］对中性洗涤纤维（Neutral detergent fiber，NDF）和酸性洗涤纤维（Acid detergent fiber，ADF）进行纤维组分分析。使用蒽酮比色法^［19］测定水溶性碳水化合物（Water-soluble carbohydrates，WSC）含量。

1.3 Illumina Hiseq2500测序和细菌多样性分析：

青贮柱花草和水稻秸秆样品中的细菌DNA通过HiPure Soil DNA提取试剂盒（广州美基生物科技有限公司，广州）提取得到，并使用1%琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测DNA质量。后对16 s rDNA的V3-V4区域进行PCR扩增，引物序列为341F：CCTACGGGNGGCWGCAG;806R：GGACTACHVGGGTATCTAAT，在50 μL的体系中进行聚合酶链反应（5 μL 10×KOD缓冲液，1.5 μL引物（5 μmol·L^-1），1 μL KOD聚合酶，5 μL 2.5 mmol·L^-1脱氧核苷三磷酸（dNTP）和100 ng模板DNA）。PCR反应程序为95℃预变性2 min，98℃变性10 s，62℃退火30 s，68℃延伸30 s，27个循环，68℃延伸10 min，10℃保存产物。PCR产物经纯化和定量后，在Illumina HiSEq 2500测序系统进行测序。在生物信息学分析之前进行质量控制和聚类，包括reads过滤、reads组装、原始数据过滤、聚类及嵌合体去除，最后使用R语言ggplot2包（2.2.1版本）对数据进行可视化。使用R语言pheatmap包绘制物种丰度热图。各组间的ɑ指数比较采用Tukey事后检验和R语言Vegan包（2.5.3版本）的Kruskal-Wallis秩和检验。包括PcoA（主坐标分析）在内的多变量统计技术在R语言Vegan包（2.5.3版本）中生成。各组间的功能差异分析采用R语言Vegan包（2.5.3版本）的Welch’s-test检验、Wilcoxon秩和检验、Kruskal-Wallis秩和检验、Tukey事后检验。

1.4 统计分析

利用IBM SPSS 20.0统计分析黄梁木叶精油对柱花草和水稻秸秆青贮发酵的影响，进行单因素分析（One-way ANOVA），采用Tukey法进行多重比较，P＜0.05表示有显著差异。生物信息学分析使用实时交互式在线数据平台Omicsmart（http：//www.omicsmart）进行。

2 结果与分析

2.1 青贮原料的特点

柱花草和水稻秸秆的青贮前特性如表1所示，柱花草和水稻秸秆的干物质含量分别为363 g·kg^-1和279 g·kg^-1，粗蛋白含量分别为99.0 g·kg^-1和72.6 g·kg^-1，真蛋白含量分别为774 g·kg^-1和619 g·kg^-1。柱花草和水稻秸秆的纤维含量较高，中性洗涤纤维分别为701 g·kg^-1和611 g·kg^-1，酸性洗涤纤维分别为473 g·kg^-1和308 g·kg^-1；可溶性糖含量较低，分别为18.1 g·kg^-1和21.6 g·kg^-1。青贮原料表面附着的微生物数量丰富，柱花草和水稻秸秆表面的酵母菌数量为5.06 lg cfu·g^-1和4.33 lg cfu·g^-1，霉菌数量为4.46 lg cfu·g^-1和3.56 lg cfu·g^-1，大肠杆菌数量为7.59 lg cfu·g^-1和6.40 lg cfu·g^-1。

2.2 柱花草和水稻秸秆的青贮发酵品质，微生物群落数量和蛋白质含量

柱花草和水稻秸秆的青贮发酵品质，微生物群落数量和蛋白质含量见表2和表3。在添加黄梁木叶精油后，青贮柱花草与水稻秸秆的pH值，柱花草的乙酸含量，水稻秸秆的丁酸含量均显著降低（P＜0.05），而两种青贮牧草的乳酸含量和水稻秸秆的乙酸含量均显著增加（P＜0.05）。同时，在添加黄梁木叶精油后青贮饲料中乳酸菌和大肠杆菌数量显著降低（P＜0.05），酵母和霉菌的数量也均低于检测水平。黄梁木叶精油的添加使青贮柱花草的真蛋白含量（P＜0.05）显著增加，非蛋白氮含量显著降低（P＜0.05），青贮柱花草和水稻秸秆的氨态氮含量均显著降低（P＜0.05）。

2.3 柱花草和水稻秸秆青贮的细菌多样性

在本试验中，青贮柱花草和水稻秸秆的细菌群落ɑ多样性见表4。在柱花草和水稻秸秆青贮处理中，良好覆盖值均达到0.99以上，添加黄梁木叶精油能使Sobs，Chao1，Ace，Shannon和Simpson指数均提高，使柱花草和水稻秸秆青贮的OTUs，丰富度和多样性均提高。

2.4 柱花草和水稻秸秆青贮的细菌丰度

青贮柱花草和水稻秸秆在门水平上的细菌群落相对丰度如图2（a）所示，在属水平上的细菌群落相对丰度如图2（b）所示。添加黄梁木叶精油使厚壁菌门（69.1%到53.3%）、变形菌门（25.6%到6.46%）数量减少，而使蓝藻门（1.91%到22.9%）和放线菌门（1.73%到7.93%）数量增加。在柱花草青贮处理中，黄梁木叶精油使乳酸菌减少（16.9%到4.05%），异根瘤菌增加（1.11%到7.02%），甲基杆菌增加（1.54%到7.74%）。在水稻秸秆青贮处理中，乳杆菌、黄单胞杆菌、乳球菌和明串球菌占主导地位，这些属的丰度也因添加黄梁木叶精油的处理而发生变化。水稻秸秆青贮细菌群落热图如图3所示，添加黄梁木叶精油降低了梭状芽孢杆菌的丰度，16S rRNA基因预测的柱花草和水稻秸秆青贮功能热谱图如图4所示。黄梁木叶精油添加组和对照组之间有明显差异。

3 讨论

3.1 青贮原料的特点

从柱花草和水稻秸秆的高粗蛋白含量可见，它们可以作为缓解全球饲料供应压力的有效蛋白质资源^［20］。真蛋白在蛋白质利用中起到重要作用，虽然柱花草和水稻秸秆中的真蛋白含量高，但它们的纤维含量过高，难以被直接利用，因此需要采用合适的加工方式进行处理。青贮作为一种常用的新鲜牧草保存方式，不仅可以为牲畜提供全年所需的饲料^［21］，还可以提高饲料的质量，使饲料的气味香，口感佳^［22］。影响青贮品质的关键因素有原料的可溶性糖含量和主要附生于乳酸菌的附生微生物等^［23］。可溶性糖是青贮饲料的发酵底物，主要是由细菌分解代谢产生有机酸，使得青贮的pH值降低。一般来说，为得到保存良好的青贮饲料，饲料的可溶性糖含量需超过60～70 g·kg^-1［24］，而在本研究中，柱花草与水稻秸秆的可溶性糖含量远远不满足需求，这意味着有机酸产量将极大受限，导致青贮过程中的高pH值无法抑制梭状芽孢杆菌等有害细菌^［25］。有研究者认为，要保证青贮品质良好，乳酸菌含量至少达到5 lg cfu·g^{-1 ［26］}。本研究青贮原料中乳酸菌数量多，柱花草中乳酸菌含量为6.29 lg cfu·g^-1，水稻秸秆中为6.18 lg cfu·g^-1，但同时其他微生物含量亦高，如酵母（柱花草为5.06 lg cfu·g^-1，水稻秸秆为4.33 lg cfu·g^-1），霉菌（柱花草为4.46 lg cfu·g^-1，水稻秸秆为3.56 lg cfu·g^-1）和大肠杆菌（柱花草为7.59 lg cfu·g^-1，水稻秸秆为6.40 lg cfu·g^-1）。不同种类的微生物会竞争不足的底物进行好氧或厌氧发酵，这表示在柱花草与水稻秸秆青贮的早期阶段，乳酸菌可能难以占据主导地位。因此，青贮原料的上述特性表明，如不添加适当的青贮添加剂，由于可溶性糖含量不足和不良微生物带来的影响，柱花草和水稻秸秆是难以直接进行青贮处理的。

3.2 柱花草和水稻秸秆的青贮发酵品质，微生物群落数量和蛋白质含量

添加黄梁木叶精油对青贮的pH值、乳酸、乙酸、乳酸菌和大肠杆菌数量及氨态氮含量均有显著影响。青贮过程中利用附生微生物并将其转化为可溶性糖以生成有机酸，而青贮的pH值会随着有机酸的积累而降低。在本试验中，柱花草和水稻秸秆的青贮处理均呈现较高的pH值，且柱花草青贮后的pH值高于水稻秸秆青贮pH值（pH＞4.20，青贮保存效果佳），这表明不同的饲料在青贮过程中的pH值变化是不同的，有研究表示青贮原料的pH值受原料缓冲能值和蛋白质水解反应影响大^［27］。除此之外，黄梁木叶精油的添加利于青贮pH值的下降，可能是由于精油的抑菌性质抑制了大肠杆菌等不良微生物对乳酸的代谢，使乳酸的量增加，从而使青贮的pH值随着乳酸的积累而降低。在此试验中，乳酸菌发酵产物乳酸随黄梁木叶精油的添加而增加，主要反映在青贮初期pH值的下降，是占主导地位的有机酸，而乙酸主要是由乳酸菌的异质发酵而产生的^［28］。乙酸是腐败微生物的抑制剂，因此在青贮好氧暴露阶段使好氧稳定性更强^［29］。同时，在柱花草和水稻秸秆青贮材料中均未检测到丙酸，而丁酸也仅在水稻秸秆中检测到，是由于黄梁木叶精油的添加而降低了其含量。丁酸是由梭状芽孢杆菌二次发酵产生的，这对营养保存是不利的^［7］。上述有机酸组成也可以解释黄梁木叶精油改善乳酸菌发酵的原因。表2所示的微生物群落可以进一步证明黄梁木叶精油的抗菌作用。乳酸菌是青贮中最占优势的微生物，而随黄梁木叶精油的添加，乳酸菌数量显著降低，这可能是因为包括肠球菌，明串球菌，片球菌和乳球菌在内的球菌对低pH值的耐受性较差^［30-31］，一些不耐酸乳酸菌的生长受到了发酵时大量产生的乳酸的抑制。此外，添加黄梁木叶精油使青贮饲料中大肠杆菌的数量显著降低，酵母和霉菌的数量也均低于检测水平。综上所述，添加黄梁木叶精油有利于提高柱花草和水稻秸秆的青贮发酵品质。

青贮饲料的蛋白质组成是评价发酵品质的重要指标，而饲料的青贮处理目的是对牧草中生物质和营养的高效保存，然而由于蛋白质水解而引起的营养损失是不可避免的。蛋白质水解也称为蛋白质降解，是一种动态的酶和微生物的反应过程，将真蛋白转化为包括小肽、游离氨基酸氮和氨态氮在内的非蛋白氮^［30］。因此，青贮过程中蛋白质的水解不仅会使青贮品质降低，而且会产生过多的瘤胃可降解的蛋白质。许多研究聚焦关注青贮过程中蛋白质的保存，如单宁酸提高桑叶青贮中的真蛋白比例^［14］，没食子酸降低大豆秸秆全株青贮中的氨态氮含量^［7］。

青贮饲料中的氨态氮含量是蛋白质分解的重要指标^［32］，能够直接反映青贮饲料的质量，主要与大肠杆菌等不良微生物的活性有关。因此，黄梁木叶精油的添加对降低青贮柱花草和水稻秸秆中的氨态氮含量有积极作用，它可能通过抑制大肠杆菌的生物活性从而减少氨基酸或多肽的脱氨基作用^［7］。氨态氮占非蛋白氮的比例随黄梁木叶精油的添加而增加，说明非蛋白氮中可能有丰富的多肽游离氨基酸，多肽游离氨基酸对牲畜的健康生长起到积极作用。综上所述，添加黄梁木叶精油的青贮柱花草和水稻秸秆能较好地保存青贮蛋白。

3.3 柱花草和水稻秸秆青贮的细菌多样性

近年来，许多研究证明青贮过程中的菌群与发酵质量密切相关^{［23，33］}，也因此，新一代微生物测序技术已成为青贮饲料质量评价的常规技术手段并已广泛应用。在本试验中，青贮柱花草和水稻秸秆的细菌群落ɑ多样性见表4。总体而言，两种饲料青贮处理的良好覆盖值均达到0.99以上，表明样品数据足以代表不同青贮处理中所有细菌群落。总体而言，与对照组相比，添加黄梁木叶精油使柱花草和水稻秸秆青贮的OTUs，丰富度和多样性均提高。类似试验研究发现，大豆秸秆青贮的OTUs，丰富度和多样性指数也随没食子酸的添加而增加^［7］。此外，单独青贮的两种牧草的细菌群落与经黄梁木叶精油添加处理的样品有明显区别。由此可见，添加0.5%和1.0%黄梁木叶精油的柱花草和水稻秸秆青贮发酵品质较好，可能是因为精油的添加提高了细菌群落的多样性、组成和丰度，从而使发酵品质提高。

3.4 柱花草和水稻秸秆青贮的细菌丰度

细菌群落积累图谱可以清晰地反映出门和属水平上的多样性和丰度变化，总体而言，在柱花草青贮处理中，厚壁菌门、变形菌门、蓝藻门和放线菌门是前四大优势门，黄梁木叶精油的添加极大程度地改变了这些门的相对丰度。在水稻秸秆青贮处理中，前四大优势门与柱花草青贮处理一致，但添加黄梁木叶精油前后，厚壁菌门、变形菌门、蓝藻门和放线菌门的变化都不大。该试验结果与此前其他研究者的发现基本一致^［34］，即厚壁菌门和变形菌门是大麦青贮处理中最占优势的门（占总相对丰度的99%以上）。蓝藻菌和放线菌也常见于许多其他青贮处理中^{［21，30］}，但青贮柱花草与青贮水稻秸秆在属水平上的细菌群落组成和丰度还是存在较大差异。在水稻秸秆青贮处理中，乳杆菌、黄单胞杆菌、乳球菌和明串球菌占主导地位，这些属的丰度也因添加黄梁木叶精油的处理而发生变化。一般来说，乳杆菌作为一种严格同质发酵的乳酸菌，可以分解1 mol葡萄糖产生2 mol乳酸，从而在青贮初期使pH值快速降低，抑制梭状芽孢杆菌等不良细菌^［35］。添加黄梁木叶精油降低了梭状芽孢杆菌的丰度，在青贮过程中梭状芽孢杆菌是不利于饲料蛋白质和干物质保存的属^［36］。与此同时，乳杆菌和其他乳酸菌（包括魏斯氏菌、肠球菌和乳球菌）通常被用作青贮饲料添加剂^［37］，目的是在可溶性糖不足的饲料青贮发酵过程中占据主导地位。但在水稻秸秆青贮处理中，添加黄梁木叶精油使乳球菌和明串球菌的相对丰度降低了，这可能是因为这两个属的耐酸能力弱^［31］。明串球菌是发酵初期到中期的优势菌属^［38］，后期明串球菌的数量减少可能反映了经添加黄梁木叶精油处理青贮饲料后，干物质含量较高的原因，因为明串球菌是厌氧发酵过程中二氧化碳的主要来源^［39］。由于可以抑制大肠杆菌和真菌的生长^［40］，从而降低苜蓿青贮中的pH值和氨态氮含量^［41］，泛菌在柱花草青贮中占据着主导地位。青贮中甲基杆菌的相对丰度因黄梁木叶精油的添加而增加。甲基杆菌是一种严格的嗜中性和需氧细菌，在饲料青贮中常见^［7］。甲基杆菌在碳循环中起到了至关重要的作用^［42］，且其还可用于发酵工业中生产各种氨基酸、辅酶和维生素^［43］。异根瘤菌在生物固氮中起重要作用，同时它常导致葡萄在栽培过程中感冠瘿病^［44］。添加黄梁木叶精油提高了水稻秸秆青贮中黄单胞杆菌的丰度，但有研究证明^［45］黄单胞杆菌是植物病原体，会导致许多牧草品种患细菌性枯萎病。甲基杆菌、异根瘤菌和黄单胞杆菌在青贮中的具体功能尚不明确，我们预估黄梁木叶精油可能是通过改变细菌群落的多样性和丰度来改善青贮质量。与柱花草青贮相比，水稻秸秆青贮的发酵品质更好，可能是由于水稻秸秆青贮中有较为理想的菌群，乳杆菌、明串球菌和乳球菌的丰度高，而异根瘤菌和甲基杆菌的丰度低。添加黄梁木叶精油对柱花草和水稻秸秆青贮的脂质、能量、碳水化合物和氨基酸代谢均有促进作用。随黄梁木叶精油的添加，生物合成和其他次生代谢产物的量也在增加，说明黄梁木叶精油不仅是可以提高青贮品质的有效添加剂，而且在畜牧业中具有潜在的生物学功能。

4 结论

本研究表明，添加黄梁木叶精油可以降低柱花草和水稻秸秆青贮过程中的pH值、氨态氮含量、乳酸菌和大肠杆菌的数量，提高水稻秸秆青贮中乳酸的含量和真蛋白的比例，增加细菌多样性和最优势属乳杆菌的相对丰度。综上所述，添加1%黄梁木叶精油可有效改善柱花草和水稻秸秆青贮发酵品质。

参考文献

［1］LI M，ZHOU H，ZI X，et al. Silage fermentation and ruminal degradation of stylo prepared with lactic acid bacteria and cellulase［J］. Animal Science Journal，2017，88（10）：1531-1537

［2］黄乃馨，李雪枫，展小霞，等. 含水量对柱花草青贮品质和微生物群落动态的影响［J］. 草地学报，2024，55（1）：232-244

［3］PEN M，SAVAGE D B，NOLAN J V，et al. Effect of stylosanthes guianensis supplementation on intake and nitrogen metabolism of Bos indicus cattle offered a basal diet of mixed rice straw and tropical grass［J］. Animal Production Science，2013，53（5）：453-457

［4］NGUYEN V H，TOPNO S，BALINGBING C，et al. Generating a positive energy balance from using rice straw for anaerobic digestion［J］. Energy Reports，2016，2：117-122

［5］ZHAO J，DONG Z，LI J，et al. Ensiling as pretreatment of rice straw：the effect of hemicellulase and Lactobacillus plantarum on hemicellulose degradation and cellulose conversion［J］. Bioresource Technology，2018，266：158-165

［6］王成，王益，周玮，等. 植物乳杆菌和含水量对辣木叶青贮品质和单宁含量的影响［J］. 草业学报，2019，28（6）：109-118

［7］WANG C，ZHENG M，WU S，et al. Effects of gallic acid on fermentation parameters，protein fraction，and bacterial community of whole plant soybean silage［J］. Frontiers in Microbiology，2021，12：662966

［8］LIU Q，ZHANG J，SHI S，et al. The effects of wilting and storage temperatures on the fermentation quality and aerobic stability of stylo silage［J］. Animal Science Journal，2011，82（4）：549-553

［9］SHINOZAKI Y，KITAMOTO H K. Ethanol production from ensiled rice straw and whole-crop silage by the simultaneous enzymatic saccharification and fermentation process［J］. Journal of Bioscience and Bioengineering，2011，111（3）：320-325

［10］SILVA L D D，PEREIRA O G，SILVA T C D，et al. Effects of silage crop and dietary crude protein levels on digestibility，ruminal fermentation，nitrogen use efficiency，and performance of finishing beef cattle［J］. Animal Feed Science and Technology，2016，220：22-33

［11］杨丹，吴硕，陈丹丹，等. 黄梁木精油活性成分测定及其对全株玉米青贮有氧稳定的影响［J］. 草地学报，2023，31（9）：2860-2867

［12］SU G，ZHOU X，WANG Y，et al. Dietary supplementation of plant essential oil improves growth performance，intestinal morphology and health in weaned pigs［J］. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition，2020，104（2）：579-589

［13］张德安，杨若渚，刘杰，等. 饲喂青贮黄梁木代替青贮玉米川中黑山羊肝转录组的表达分析［J］. 畜牧兽医学报，2024，55（1）：232-244.

［14］WANG C，PIAN R，CHEN X，et al. Beneficial effects of tannic acid on the quality of bacterial communities present in high-moisture mulberry leaf and stylo silage［J］. Frontiers in Microbiology，2020，11：586412

［15］KE W，DING Z，LI F，et al. Effects of malic or citric acid on the fermentation quality，proteolysis and lipolysis of alfalfa silage ensiled at two dry matter contents［J］. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition，2022，106（5）：988-994

［16］ZHANG Q，YU Z，YANG H，et al. The effects of stage of growth and additives with or without cellulase on fermentation and in vitro degradation characteristics of Leymus chinensis silage［J］. Grass and Forage Science，2016，71（4）：595-606

［17］Official methods of analysis of AOAC International［J］. Choice Reviews Online，1997，35（2）：128

［18］VANSOEST P J，ROBERTSON J B，LEWIS B A. Methods for dietary fiber，neutral detergent fiber，and nonstarch polysaccharides in relation to animal nutrition［J］. Journal of Dairy Science，1991，74（10）：3583-3597

［19］MURPHY R P. A method for the extraction of plant samples and the determination of total soluble carbohydrates［J］. Journal of the Science of Food and Agriculture，1958，9（11）：714-717

［20］LAZZARI G，POPPI A C O，MACHADO J，et al. Effects of protein source and lipid supplementation on conservation and feed value of total mixed ration silages for finishing beef cattle［J］. Journal of Animal Science，2021，99（2）：1-13

［21］CHEN D，ZHENG M，GUO X，et al. Altering bacterial community：A possible way of lactic acid bacteria inoculants reducing CO production and nutrient loss during fermentation［J］. Bioresource Technology，2021，329：124915

［22］YANG H，WANG B，ZHANG Q，et al. Improvement of fermentation quality in the fermented total mixed ration with oat silage［J］. Microorganisms，2021，9（2）：420

［23］NI K，WANG X，LU Y，et al. Exploring the silage quality of alfalfa ensiled with the residues of astragalus and hawthorn［J］. Bioresource Technology，2020，297：122249

［24］SMITH L H. Theoretical carbohydrate requirement for alfalfa silage production［J］. Agronomy Journal，1962，54（4）：291-293

［25］WANG Y，WANG C，ZHOU W，et al. Effects of wilting and lactobacillus plantarum addition on the fermentation quality and microbial community of moringa oleifera leaf silage［J］. Frontiers in Microbiology，2018，9：1817

［26］CAI Y，BENNO Y，OGAWA M，et al. Influence of lactobacillus spp. from an inoculant and of weissella and leuconostoc spp. from forage crops on silage fermentation［J］. Applied and Environmental Microbiology，1998，64（8）：2982-2987

［27］KUNG L J，SMITH M L，BENJAMIM D S E，et al. An evaluation of the effectiveness of a chemical additive based on sodium benzoate，potassium sorbate，and sodium nitrite on the fermentation and aerobic stability of corn silage［J］. Journal of Dairy Science，2018，101（7）：5949-5960

［28］MCDONALD P，HENDERSON A，HERON S. The biochemistry of silage［M］. 2nd ed. Marlow：Chalcombe publications，1991：9-12

［29］SEGLAR B. Fermentation analysis and silage quality testing［D］. Minneapolis，Minnesota：University of Minnesots，2003：126

［30］HE L，CHEN N，LV H，et al. Gallic acid influencing fermentation quality，nitrogen distribution and bacterial community of high-moisture mulberry leaves and stylo silage［J］. Bioresource Technology，2020，295：122255

［31］PANG H，QIN G，TAN Z，et al. Natural populations of lactic acid bacteria associated with silage fermentation as determined by phenotype，16 s ribosomal RNA and recA gene analysis［J］. Systematic and Applied Microbiology，2011，34（3）：235-241

［32］PAHLOW G，MUCK R E，DRIEHUIS F，et al. Microbiology of ensiling［J］. Silage Science and Technology，2003，42：31-93

［33］DONG Z，SHAO T，LI J，et al. Effect of alfalfa microbiota on fermentation quality and bacterial community succession in fresh or sterile Napier grass silages［J］. Journal of Dairy Science，2020，103（5）：4288-4301

［34］LIU B，HUAN H，GU H，et al. Dynamics of a microbial community during ensiling and upon aerobic exposure in lactic acid bacteria inoculation-treated and untreated barley silages［J］. Bioresource Technology，2019，273：212-219

［35］DUNIERE L，SINDOU J，CHAUCHEYRAS-DURAND F，et al. Silage processing and strategies to prevent persistence of undesirable microorganisms.［J］. Animal Feed Science and Technology，2013，182（1/4）：1-15

［36］ZHENG M L，NIU D Z，JIANG D，et al. Dynamics of microbial community during ensiling direct-cut alfalfa with and without LAB inoculant and sugar［J］. Journal of Applied Microbiology，2017，122（6）：1456-1470

［37］NI K，ZHAO J，ZHU B，et al. Assessing the fermentation quality and microbial community of the mixed silage of forage soybean with crop corn or sorghum［J］. Bioresource Technology，2018，265：563-567

［38］PLENGVIDHYA V，BREIDT F J，LU Z，et al. DNA fingerprinting of lactic acid bacteria in sauerkraut fermentations［J］. Applied and Environmental Microbiology，2007，73（23）：7697-7702

［39］ZHAI Y，PEREZ-DIAZ I M. Contribution of Leuconostocaceae to CO-mediated bloater defect in cucumber fermentation［J］. Food Microbiology，2020，91：103536

［40］DUTKIEWICZ J，MACKIEWICZ B，LEMIESZEK M K，et al. Pantoea agglomerans：a mysterious bacterium of evil and good. Part.Ⅳ. Beneficial effects［J］. Annals of Agricultural and Environmental Medicine：Aaem，2016，23（2）：206-222

［41］OGUNADE I M，JIANG Y，CERVANTES A A P，et al. Bacterial diversity and composition of alfalfa silage as analyzed by illumina Miseq sequencing：effects of Escherichia coli O157：H7 and silage additives［J］. Journal of Dairy Science，2018，101（3）：2048-2059

［42］HOLLAND M. Methylobacterium and plants［J］. Recent Res Dev in Plant Physiol，1997，1：207-213

［43］GREEN P N. About this rererence work［J］.Bergey′s Manual，2015，7：60608

［44］TURGUT A，BASIM H. Development of a real-timePCR assay using locked nucleic acid probe for the detection of octopine，nopaline，and vitopine strains of tumorigenic Allorhizobium vitis in grapevines［J］. Crop Protection，2021，145：105620

［45］WICHMANN F，HUG B M，WIDMER F，et al. Phenotypic and molecular genetic characterization indicate no major race-specific interactions between Xanthomonas translucens pv. Graminis and lolium multiflorum［J］. Plant Pathology，2011，60（2）：314-324

（责任编辑 刘婷婷）