土壤中氯嘧磺隆及其降解产物对后茬玉米生长及其ALS酶活性的影响

摘要试验采用超高效液相色谱高分辨飞行时间质谱联用法检测土壤中氯嘧磺隆的主要降解产物，推测出氯嘧磺隆在土壤中的降解途径，同时分析了土壤中氯嘧磺隆及其降解产物对后茬作物玉米生长及ALS活性的影响。结果表明：土壤中氯嘧磺隆的降解产物对玉米的抑制作用明显低于氯嘧磺隆本身;低浓度下，氯嘧磺隆及其降解产物对玉米作物的抑制作用均不明显，甚至降解产物对玉米生长有促进作用;高浓度下，氯嘧磺隆及其降解产物对玉米的抑制作用显著。

关键词氯嘧磺隆;除草剂;降解产物;超高效液相色谱高分辨飞行时间质谱联用

中图分类号：S 482.4文献标识码：ADOI：10.16688/j.zwbh.2023608The effects of chlorimuron-ethyl and its degradation products on the growth

and ALS enzyme activity in subsequent maizeCAO Jiaqi，FU Ying，ZOU Yueli*（College of Arts and Sciences， Northeast Agricultural University， Harbin150030， China）AbstractIn this study， the main degradation products of chlorimuron-ethyl in soil were detected using high-performance liquid chromatography-high resolution time-of-flight mass spectrometry. The effects of chlorimuron-methyl and its degradation products in soil on the growth and ALS activity of maize were also analyzed. The results showed that the inhibitory effect of chlorimuron-ethyl degradation products on maize in soil was significantly lower than that of chlorimuron-ethyl itself. At low concentrations， chlorimuron-ethyl and its degradation products had no obvious inhibitory effect on maize crops， and some degradation products even promoted maize growth. At high concentrations， the inhibitory effect of chlorimuron-ethyl and its degradation products on maize was significant.

Key wordschlorimuron-ethyl;herbicide;degradation products;high-performance liquid chromatography-high resolution time-of-flight mass spectrometry

大豆田除草剂氯嘧磺隆，英文通用名称为chlorimuron-ethyl，化学名称为2-（4-氯-6-甲氧基嘧啶-2-氨基甲酰氨基磺酰基）苯甲酸乙酯，是一种超高效、广谱的大豆田苗后除草剂，可通过抑制植物中的乙酰乳酸合酶（ALS）活性来杀死杂草。氯嘧磺隆在土壤中残留时间长，在土壤中少量残留即可对后茬敏感作物（如玉米、甜菜等）产生药害［13］。国内外研究表明，氯嘧磺隆可以发生水解、光解和微生物降解等多种代谢途径［46］。然而还未见关于氯嘧磺隆在土壤中的降解途径及其降解产物对后茬作物玉米生长和酶活性影响的报道。

目前超高效液相色谱法为除草剂残留物检测的主要方式［710］，试验采用超高效液相色谱高分辨飞行时间质谱联用（UPLCI-Class-Q-TOF-MS145e72c14a401848e4f49607cfcabb8b）技术对土壤中氯嘧磺隆除草剂降解产物进行测定，检测到氯嘧磺隆4种主要降解产物，并对其降解机理进行了推测。同时，试验测定了氯嘧磺隆及其4种降解产物对玉米生长的影响;分析了受氯嘧磺隆污染的大豆田土壤中残留的氯嘧磺隆及其降解产物对后茬作物玉米可能产生的危害，对除草剂氯嘧磺隆的环境风险评估提供了重要信息。

1材料与方法

1.1仪器

Waters uplc I-Class超高效液相色谱仪（美国沃特斯公司），Waters Xevo G2-XS QTOF质谱仪（美国沃特斯公司），AL-4型电子分析天平（万分之一，瑞士梅特勒公司），KQ-500DB 型超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司），Allegra64型台式高速离心机（美国贝克曼库尔特有限公司）。

1.2样品与试剂

乙腈、甲醇、甲酸（质谱纯，赛默飞世尔公司），亮氨酸脑酚酞、甲酸钠（美国沃特斯公司），超纯水（屈臣氏公司），多菌灵（CAS号： 10605-21-7）、2-（氨基磺酰基）苯甲酸乙酯（CAS号：59777-72-9）、2-（氨基磺酰基）苯甲酸（CAS号： 632-24-6）（标准品，源叶公司），氯嘧磺隆（CAS号：90982-32-4）、2-氨基-4-氯-6-甲氧基嘧啶（CAS号：5734-64-5）、1，2-苯并异噻唑啉-3-酮（CAS号：81-07-2）（标准品，坛墨质检标准物质中心）。

1.3色谱－质谱检测

色谱条件：色谱柱为Acquity uplcbeh C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm，ACQUITY UPLC BEH公司），流动相A为甲酸水（0.1%甲酸），流动相B为乙腈，梯度洗脱（0.0～1.0 min，90%→70%;1.0～2.5 min，70%→55%;2.5～5.0 min，55%→30%;5.0～8.9 min，30%→10%;8.9～12.9 min，10%→10%;12.9～14.0 min，10%→90%;14.0～15.0 min，90%→90%），柱温30℃，流速0.3 mL/min。

质谱条件：采用电喷雾离子源（ESI），正离子扫描模式，毛细管电压2.5 kV，样品锥孔电压40 V，离子源缺省电压80 V，离子源温度120℃，脱溶剂温度350℃，锥孔气流速50 L/h，脱溶剂气流速800 L/h，质量扫描范围m/z 50～1 200。

1.4氯嘧磺隆及其降解产物的提取

取黑龙江省绥化市青冈县受氯嘧磺隆除草剂污染的大豆田表层土壤，阴干，过100目筛。取10 g土壤样品，用甲醇水溶液超声提取，过滤后高速离心，合并提取液［911］。将Waters Oasis MCX固相萃取小柱以甲醇和水活化、润湿，注入土壤提取液100～500 mL，用超纯水和甲醇淋洗，将洗脱液浓缩到1.5 mL左右，超速离心后取上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤后进行高分辨质谱分析。

1.5玉米生长指标和ALS酶活性测定

1.5.1玉米幼苗的培育方法

选择若干优质玉米种子，经45℃温水和0.6%多菌灵溶液各浸泡30 min后用蒸馏水洗涤并在蒸馏水中浸泡12 h，将种子取出后放置在培养皿中，置于温度28℃、相对湿度75%的生长室中发芽24 h。然后，将发芽的种子播种在装满干燥土壤的纸杯中，每杯5粒，置于自然温度、湿度和光照条件下的生长室中。

1.5.2氯嘧磺隆及降解产物对玉米的作用

播种后，在种有玉米的杯子中分别加入60 mL 0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/L浓度的氯嘧磺隆溶液［1214］及其4种降解产物［2-氨基-4-氯-6-甲氧基嘧啶、2-（氨基磺酰基）苯甲酸乙酯、2-（氨基磺酰基）苯甲酸、1，2-苯并异噻唑啉-3-酮］样品溶液，对照用蒸馏水处理，每个样品重复3次（测定15株）。3 d后，分别在各杯中加入40 mL蒸馏水，进行培养。

1.5.3玉米的生长水平分析

处理7 d后将玉米幼苗从杯中取出，冲洗干净，控水后用滤纸吸干。测定玉米幼苗的地上部和根部的长度、地上部和根的鲜重4个生长指标。玉米的抑制率（IR，%）用以下公式计算：IR=（1-T/C）×100;其中T为处理玉米的净重（或长度），C为对照的净重（或长度）。

1.5.4玉米体内ALS活性的测定

处理7 d后收集玉米苗，并用于测定玉米叶片中的ALS活性［1216］。

标准工作曲线制作：配制500 nmol/L乙酰甲基甲醇溶液，并稀释得到10、25、50、75、100、150、200 nmol/L系列溶液，取0.4 mL上述标准溶液，加入硫酸0.1 mL，pH为7的磷酸缓冲液0.6 mL，5%甲萘酚溶液0.5 mL和0.5%肌酸0.5 mL，放置于60℃水浴中充分反应15 min，测定该溶液在525 nm处的吸光度值，重复3次，制作标准工作曲线。

提取ALS：配制酶提取液、酶溶解液、酶反应液［1617］。取1.0 g玉米叶片，加入配制好的酶提取液3.0 mL，加入液氮并研磨，转入离心管以石英砂调平衡后25 000 g离心20 min，取上清液2.0 mL，加入提取液3.0 mL。加入1.5 g （NH4）2SO4，并小心振荡使其混合均匀。放置于冰箱中2 h使其沉降， 离心20 min（25 000 g，4℃），去上清后加入酶溶解液3.0 mL溶解沉淀，即得到玉米叶片ALS提取液。

ALS活性测定：取上述ALS提取液0.4 mL，加入0.05 mol/L pH为7的磷酸缓冲液0.1 mL，加入酶反应液0.5 mL，混合均匀后置于35℃水浴中并遮挡使其在暗处反应，1 h后加入 3 mol/L的H2SO4 0.1 mL 终止反应，再放入60℃水浴中进行脱羧反应，15 min后加入0.5% 肌酸0.5 mL 和用2.5 mol/L NaOH配制的5%甲萘酚溶液0.5 mL，继续在60℃水浴中进行显色反应，15 min后取出放至冷却，测定其在525 nm处的吸光度值并与标准工作曲线对比，计算得到乙酰甲基甲醇含量，ALS的活力单位表示为nmol/（h·mg）。体内ALS活性以对照的百分比表示，所有数据均采用SPSS 16.0统计软件进行统计分析，对照组和处理组之间的比较通过多重比较的 Tukey法进行方差分析。

ALS相对活性=化合物处理值/对照处理值×100%。

2结果与分析

2.1高分辨质谱解析

根据氯嘧磺隆及其降解产物的质荷比（m/z），再结合MS图的带电离子相对峰度以及氯嘧磺隆母体化合物的结构等特点和质谱图解析方法，进一步确定土壤中氯嘧磺隆降解产物的分子结构（表1）。

2.2氯嘧磺隆及其降解产物对玉米的影响

2.2.1氯嘧磺隆对玉米生长指标的影响

如表2所示，氯嘧磺隆导致玉米生长水平显著降低，对玉米4个生长指标的抑制率均随着氯嘧磺隆浓度的增加而升高，对地下部分根长和根鲜重的抑制率均高于地上部长度和地上部鲜重。

2.2.2降解产物A对玉米生长指标的影响

如表3所示，降解产物A（2-氨基-4-氯-6-甲氧基嘧啶）导致玉米生长水平显著降低，对玉米4个生长指标的抑制率均随着其浓度的增加而升高，对地下部分的根长和根鲜重的抑制率均高于地上部长度和地上部鲜重。

2.2.3降解产物B对玉米生长指标的影响

如表4所示，降解产物B［2-（氨基磺酰基）苯甲酸乙酯］对玉米生长水平的影响对于玉米各个部分有明显差别，其对玉米地上部分（包括地上部长度和地上部鲜重）有促进作用，且随着浓度的增加促进作用先增强后减弱;对玉米地下部的生长有着较强的抑制作用，抑制率随着浓度增加有升高的趋势。

2.2.4降解产物C对玉米生长指标的影响

如表5所示，降解产物C［2-（氨基磺酰基）苯甲酸］对玉米生长水平的影响与降解产物B类似，可能是由于降解产物B和降解产物C结构较为相似。对玉米根系的抑制率随着降解产物C浓度的增加而升高。产物C对玉米地上部（包括地上部长度和地上部鲜重）没有抑制作用，而是促进了玉米地上部的生长，在0.3 mg/L时促进作用最为显著。

2.2.5降解产物D对玉米生长指标的影响

如表6所示，在所有降解产物中，降解产物D（1，2-苯并异噻唑啉-3-酮）是唯一一种不抑制玉米生长，反而具有促进生长作用的降解产物，促进作用随着降解产物D浓度的增加而增加。

2.2.6氯嘧磺隆及其降解产物对ALS活性的影响

ALS是磺酰脲类除草剂在植物体内的靶标酶，在某些情况下，ALS活性的降低表达了除草剂对植物的抑制作用。在本研究中，基于对玉米生长水平的影响结果，研究并比较了0.5 mg/L氯嘧磺隆和4种降解产物对玉米ALS的影响（表7）。结果表明，氯嘧磺隆导致ALS活性显著降低，降解产物A对ALS活性有明显降低趋势，而其他3种降解产物对玉米中ALS活性几乎没有影响。

3结论与讨论

本试验研究了土壤中氯嘧磺隆的降解产物，同时分析了氯嘧磺隆及其4种降解产物对玉米生长的影响。结果表明，土壤中氯嘧磺隆主要存在4种降解产物，产物A：2-氨基-4-氯-6-甲氧基嘧啶，产物B： 2-（氨基磺酰基）苯甲酸乙酯，产物C：2-（氨基磺酰基）苯甲酸，产物D：1，2-苯并异噻唑啉-3-酮。生物活性测定结果表明，氯嘧磺隆及其降解产物对玉米根的作用比对地上部的作用更明显。在相同浓度下，氯嘧磺隆对玉米生长的抑制率最高。对于测试的4种降解产物，发现在相同浓度下，产物A对玉米的抑制率高于其他降解产物，而产物D对玉米的生长具有促进作用。ALS活性测定的结果表明，氯嘧磺隆对玉米ALS活性的影响效果显著，降解产物A影响次之，其余3种降解产物对玉米中的ALS活性几乎没有影响。基于此研究可知，氯嘧磺隆在土壤中完全降解后可以显著降低其环境危害风险。

国内外研究表明，磺酰脲类除草剂在弱酸性条件下的主要降解途径是脲桥键裂解，发生水解反应，水分子攻击羰基碳的中性桥，释放出CO2，生成无任何除草活性的磺酰胺和杂环胺，而磺酰胺和杂环胺还可进一步水解［1819］。在中性和弱碱性条件下，只有苯环上的酯水解及脲桥裂解，嘧啶环上甲氧基稳定，没有脱甲氧基反应发生。从而推测出氯嘧磺隆在土壤中的降解途径：氯嘧磺隆的磺酰脲桥发生断裂，生成产物A和产物B;产物B发生水解反应生成产物C;产物C发生环化反应生成产物D（图1）。

除草剂氯嘧磺隆在土壤中具有长期持久性，其残留物对后茬敏感作物具有较大的侵害，严重影响种植结构的调整［2023］。试验研究了施用过氯嘧磺隆除草剂的大豆田中可能存在的氯嘧磺隆降解产物，以及可能在施用过程中过量的氯嘧磺隆除草剂本身对后茬作物玉米的危害，证明了氯嘧磺隆降解后的产物在低浓度下对后茬作物玉米的抑制作用并不明显，部分降解产物对于玉米的生长甚至有促进作用，但在实际施用过程中可能会施用过量氯嘧磺隆除草剂，导致其在自然条件下无法完全降解或使土壤中降解产物浓度过高，从而抑制后茬作物的生长。施用过氯嘧磺隆除草剂的大豆田在对于后茬作物的选择上要更为谨慎，应特别关注氯嘧磺隆除草剂在土壤中的残留动态及不同后茬作物的安全性问题。

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（责任编辑：田喆）