广东省雷州市捕获鼠的物种鉴定及抗性水平评估

摘要抗凝血灭鼠剂在广东已使用40多年，评估不同鼠类种群的抗药性对于科学合理使用抗凝剂具有重要的指导意义。维生素K环氧化物还原酶亚基1（vitamin K epoxide reductase complex subunit 1，Vkorc1）上的错义突变可以导致鼠类对抗凝剂的抗性。本研究首先根据鼠类的外部形态特征和线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（cytochrome c oxydase subunitⅠ， COⅠ）基因对广东省雷州市乌石镇捕获的91只鼠进行物种鉴定，然后根据不同鼠类种群内的Vkorc1错义突变频率，评估当地种群对抗凝剂是否产生抗性。结果表明，COⅠ基因支持形态分类的结果，捕获的鼠种包括黑缘齿鼠Rattus andamanensis、黄毛鼠R.losea、黄胸鼠R.tanezumi和褐家鼠R.norvegicus。Vkorc1多态性分析显示，22只黑缘齿鼠中检测到1种沉默突变Ala18Ala，52只黄胸鼠中检测到2种沉默突变Ala18Ala和Ala41Ala，16只褐家鼠中检测到2种沉默突变His68His和Ile82Ile。目前乌石镇的鼠类种群没有产生与抗性相关的Vkorc1错义突变，表明当地种群对抗凝血剂的抗性水平较低，第一代抗凝剂仍可用于当地鼠害防治。

关键词鼠属;Vkorc1多态性;DNA条形码;抗药性

中图分类号：Q 959; S 443文献标识码：ADOI：10.16688/j.zwbh.2023511Species identification and assessment of resistance levels of rodents

captured in Leizhou city， Guangdong provinceSUN Ting1，YAO Dandan2，QIAO Yanting1，YAN Haojie LI Tongtong XU Jianting

YING Yaqi WANG Dawei LIU Xiaohui SONG Ying（1. Institute of Plant Protection， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing100193， China; 2. Plant

Protection Research Institute， Guangdong Academy of Agricultural Sciences， Guangzhou510640， China;

3. West Agricultural Research Center， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Changji831100， China）AbstractAnticoagulant rodenticides have been widely used in Guangdong province for over 40 years. To ensure effective and scientific application of these anticoagulant rodenticides， it is crucial to assess the level of resistance in different rat populations. Missense mutations in the vitamin K epoxide reductase complex subunit 1 （Vkorc1） gene can cause anticoagulant resistance in rats. In this study， we first identified the 91 rat samples captured in Wushi town， Leizhou city， Guangdong province based on their external morphological characteristics and mitochondrial cytochrome c oxidase subunit Ⅰ （COⅠ） gene， and then assessed the anticoagulant resistance levels based on the frequency of missense mutations in different rat populations. Results showed that the COⅠgene supported the results of morphological classification， and the captured rats comprised Rattus andamanensis， R.losea， R.tanezumi， and R.norvegicus. Analysis of Vkorc1 polymorphism revealed one silent mutation Ala18Ala in 22 individuals of R.andamanensis， two silent mutations Ala18Ala and Ala41Ala in 52 individuals of R.tanezumi， and two silent mutations His68His and Ile82Ile in 16 individuals of R.norvegicus. Currently， the rodent population in Wushi town has no Vkorc1 missense mutations associated with anticoagulant resistance， indicating a low level of anticoagulant resistance in local rat populations. This suggests that the first generation of anticoagulant rodenticides are still effective in managing the local rat populations.

Key wordsRattus;Vkorc1 polymorphism;DNA barcoding;resistance广东地区由于气候、农业产业结构等原因，鼠害长年处于中等偏重、局部发生的趋势，而且该地区还是黄胸鼠Rattus tanezumi鼠疫自然疫源地之一［12］。抗凝血灭鼠剂被广泛用于广东地区害鼠的防治，但是长期使用鼠类会对抗凝剂产生抗药性，进而降低使用效率［36］。因此，及时监测鼠类种群对抗凝剂的抗性水平对指导抗凝剂的科学使用具有重要的参考价值。

抗凝剂包括第一代（杀鼠灵、敌鼠钠盐、杀鼠醚等）和第二代（溴敌隆、溴鼠灵、氟鼠灵等）抗凝剂［7］。抗凝剂与维生素K环氧化物还原酶亚基1（vitamin K epoxide reductase complex subunit 1，Vkorc1）编码的酶结合，阻断维生素K循环，导致氧化型维生素K无法还原形成还原型维生素K，进而影响凝血因子的活化，导致啮齿动物凝血功能障碍［8］。Vkorc1基因上的突变可以导致多种鼠类对抗凝剂的抗性［9］。目前发现的与抗性相关的突变主要是错义突变，即可以导致氨基酸变异的突变。以褐家鼠Rattus norvegicus为例，已发现的错义突变有18种（Ala21Thr、Ala26Thr、Ala26Pro、Arg33Pro、Arg35Pro、Tyr39Asn、Gly46Ser、Ser56Pro、Phe63Cys、Glu67Lys、Leu120Gln、Ile123Ser、Leu128Gln、Tyr139Cys/Ser/Phe、Ser149Ile和Glu155Lys），其中已验证与抗性相关的突变包括Arg33Pro、Arg35Pro、Leu120Gln、Leu128Gln、Tyr139Cys/Phe/Ser等，被广泛用于筛选或监测抗性褐家鼠［919］。因此，可以通过分析不同鼠种的Vkorc1抗性变异及其发生频率来评估鼠类种群的抗性水平［9，17，2021］。经典的生理抗性检测方法，例如致死期食毒（lethal feeding period，LFP）法和血液凝集法要求对活鼠进行抓捕和饲养，需要的人力和物力成本较高［22］。基于抗药靶基因Vkorc1基因上的抗性变异及其频率，来评估鼠类种群的抗性，不需要对活鼠进行饲养，更加经济和高效。

广东省农区常见的鼠种包括黑缘齿鼠Rattus andamanensis、黄毛鼠Rattus losea、黄胸鼠、褐家鼠、小家鼠Mus musculus和板齿鼠Bandicota bengalensis等［2324］。目前通过LFP法在广东省的褐家鼠、黄胸鼠、黄毛鼠种群中都发现了对抗凝剂产生抗性的个体。例如，利用LFP法检测2010年湛江市区的褐家鼠抗性发生率为21.6%［25］，分析湛江麻章区褐家鼠种群的Vkorc1变异，发现一个可能与抗性相关的突变Ala140Thr，突变频率为0～4%［14］;利用LFP法在广东省的遂溪县、徐闻县、安铺镇、雷州市黄胸鼠种群中检测出抗性鼠的频率为5%～10.6%［6，2629］，分析湛江的黄胸鼠种群的Vkorc1变异，发现了对抗凝剂具有较强抗性的Tyr139Cys突变［30］;在江门市新会区和佛山市高明区利用LFP法分析黄毛鼠的抗性率分别为36.7%和16.7%［31］，在江门市黄毛鼠种群的Vkorc1基因上检测到了一个可能与抗性相关的Arg58Gly突变［32］。因此，通过分析广东不同鼠类种群的Vkorc1是否携带抗性突变及突变频率可以评估种群的抗性水平。

有研究对褐家鼠种群内已发表的Vkorc1变异进行分析，发现由于一些黑家鼠Rattus rattus或其他家鼠属Rattus物种的样品被误判为褐家鼠，导致一些种间的Vkorc1变异被误认为是褐家鼠种群内的变异［21］。因此，在分析Vkorc1基因多态性时，物种的准确鉴定十分重要。广东地区的常见鼠种，例如黑缘齿鼠、黄毛鼠、黄胸鼠和褐家鼠都属于家鼠属，形态相似性较大［33］，仅依据外表形态对这些鼠进行物种鉴定时容易发生混淆。线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（cytochrome c oxidase subunitⅠ，CO Ⅰ）基因是常用的DNA条形码标记，被广泛用于各种鼠的物种鉴定［3435］。形态鉴别结合DNA条形码技术可以更加精确地鉴定鼠种。

本研究对2022年在广东省雷州市乌石镇捕获的91只鼠样本，结合形态鉴别和DNA条形码技术，明确了所捕获鼠的鼠种组成。通过分析不同鼠种的Vkorc1基因多态性，评估其抗性水平，为当地害鼠防治过程中抗凝剂的科学使用提供参考。

1材料与方法

1.1供试鼠

2022年3月7日至20日在广东省雷州市乌石镇农村居住区（109°51′E，20°33′N）利用笼捕法捕鼠。每日傍晚沿民居外墙、道路两侧、垃圾暂存处等地放置鼠笼（长27 cm×宽14 cm×高14 cm），以新鲜花生米和胡萝卜做诱饵，次日傍晚收回。共捕获了91只鼠，通过外部形态特征，如体色、体型、头部及尾部等特征［3637］，对捕获的鼠进行物种鉴定。取1～2 cm左右的鼠尾保存于装有75%乙醇的离心管中，置于-20℃冰箱中保存备用。本试验涉及的动物实验方案遵守中国农业科学院植物保护研究所实验动物管理与伦理委员会的相关要求。

1.2捕获鼠种类的分子鉴定

1.2.1COⅠ和Vkorc1克隆

利用动物组织基因组提取试剂盒（诺唯赞，中国），按照说明书从鼠尾组织中提取基因组DNA，DNA保存于TE缓冲液（pH 8.0）中，然后置于-20℃冰箱保存备用。

PCR扩增所有样品的COⅠ和Vkorc1。COⅠ基因扩增所用的引物为BatL5310： 5′-CCTACTCR-GCCATTTTACCTATG-3′， R6036R： 5′-ACTTC-TGGGTGTCCAAAGAATCA-3′［38］。PCR反应体系为：1 μL DNA模板 （60～100 ng），正、反向引物（20 μmol/L）各1 μL，2×Taq Master Mix 12.5 μL，加ddH2O至25 μL。PCR反应条件为：94℃预变性4 min;94℃变性30 s，54℃退火40 s，72℃延伸1 min，35个循环;72℃延伸5 min。利用3对引物扩增Vkorc1全长，所用引物分别为VK1F： 5′-TGTCACGCCTAAGAATAACCA-3′， VK1R： 5′-CGA-GGGCTCAGCAAATAAG-3′; VK2F： 5′-AGGGC-AGTATAGCGAATAGA-3′， VK2R： 5′-GCCTCT-GGCTACCTAAACCT-3′; VK3F： 5′-CTGACAG-CATCCTCAACCAAT-3′和VK3R： 5′-GAGGCA-CATTTGGTCATTTT-3′［39］。PCR反应体系为：1 μL DNA模板（120～200 ng），正、反向引物（20 μmol/L）各1 μL，2×Taq Master Mix 12.5 μL，加ddH2O至25 μL。PCR反应条件为：95℃预变性5 min;95℃变性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸1 min，34个循环;72℃延伸5 min。PCR扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检测，利用ABI3730 测序仪（赛默飞，加利福尼亚州，美国）进行双向测序。

1.2.2DNA条形码分析

采用Lasergene 7.0软件［40］检查COⅠ序列峰图质量，对每个碱基逐一进行人工校正。经校对的COⅠ序列利用MEGA11软件［41］中的Clustal W进行序列比对，并计算不同鼠种种内和种间P-distance遗传距离。利用DnaSP 5.0软件［42］分析COⅠ序列的单倍型（haplotype， Hap）的组成和频率。将不同鼠种的COⅠ单倍型在NCBI数据库中进行BLAST分析，同时从NCBI数据库中下载了23条鼠的COⅠ序列作为参考序列，包括黑缘齿鼠、黄毛鼠、黄胸鼠、褐家鼠。利用MEGA 11软件［41］中的邻接（neighbor-joining，NJ）法基于Kimura 2 parameter（K2P）碱基替代模型构建系统发育树，进行1 000次自展（bootstrap）检验。利用Network 10.0软件中 Median-joining 模型［43］对单倍型数目≥3的鼠种构建单倍型网络图。

将不同的CO Ⅰ单倍型序列提交到ABGD（automatic barcode gap discovery， ABGD）网站（https：∥bioinfo.mnhn.fr/abi/public/abgd/）对样本进行物种鉴定。运行参数种内差异先验值P为0.001～0.1，最小相对gap宽度值为1.5，替换模型选择Kimura（K80），转换与颠换比率（ts/tv）为2.0。根据ABGD对单倍型的划分结果，结合系统进化分析综合鉴定物种。

1.3捕获鼠的Vkorc1多态性分析

采用Lasergene 7.0软件［40］检查Vkorc1序列峰图质量，对每个碱基逐一进行人工校正。以褐家鼠Vkorc1基因为参考序列，首先分析不同鼠种与褐家鼠种间Vkorc1编码区（486 bp）的变异，然后分析褐家鼠、黑缘齿鼠和黄胸鼠的种内Vkorc1变异，并与褐家鼠、黄胸鼠和黑家鼠中已发表的抗性相关DNA变异［919］进行比较。褐家鼠中已验证与抗性相关的变异包括Arg33Pro、Arg35Pro、Leu120Gln、Leu128Gln、Tyr139Cys/Phe/Ser等［9，1819］，黄胸鼠中报道的Tyr139Cys［30］，黑家鼠中已验证与抗性相关的变异包括Tyr25Phe、Ala41Val、Ala41Thr，、Arg61Trp和 Leu76Pro［4445］。分析不同鼠种群中是否存在可以导致氨基酸变异的抗性相关变异，根据种群内抗性相关变异的频率评估种群的抗性水平。

2结果与分析

2.1捕获鼠的种类

根据形态特征，捕获的91只鼠共有4种，其中黄胸鼠为优势种，占57.1%，其次是黑缘齿鼠和褐家鼠，分别占24.2%和17.6%，黄毛鼠最少，占1.1%。

根据DNA条形码特征，91只捕获鼠的COⅠ序列（633 bp）共包含20种不同的单倍型（Hap1～Hap20），这些单倍型包含117个变异位点（variable sites），其中有99个简约信息位点（parsimony informative sites）（图1）。根据COⅠ单倍型鉴定为黑缘齿鼠（Hap1～Hap11，ABGD1）、黄毛鼠（Hap12，ABGD2）、黄胸鼠（Hap13～Hap18，ABGD4）和褐家鼠（Hap19， ABGD5;Hap20，ABGD6）（图2）。

在黑缘齿鼠种群中，22个个体共包含11个不同的单倍型（图3a），分别为Hap1（n=7），Hap2（n=2），Hap3（n=1），Hap4（n=2），Hap5（n=1），Hap6（n=1），Hap7（n=1），Hap8（n=1），Hap9（n=1），Hap10（n=4）和Hap11（n=1）。黑缘齿鼠的COⅠ单倍型Hap1～Hap11与黑家鼠海南亚种Rattus rattus hainanicus、黑家鼠滇西亚种Rattus rattus sladeni和黑缘齿鼠的相似性均大于98%。ABGD分析显示Hap1～Hap11为同一聚类，但进化树分析显示Hap1～Hap8与黑家鼠海南亚种聚在一起，Hap9～Hap11与黑家鼠滇西亚种聚在一起。单倍型网络图显示Hap9～Hap11与Hap1～Hap8之间存在至少5个碱基的差异。

在黄胸鼠种群中，52个个体共包含6个COⅠ单倍型（图3b），分别为Hap13（n=1），Hap14（n=1），Hap15（n=2），Hap16（n=2），Hap17（n=45），Hap18（n=1）。黄胸鼠单倍型网络图（图3b）显示，Hap17为主单倍型，包括了黄胸鼠种群的绝大多数个体（86.5%）。在褐家鼠种群中，16个个体共包含2个单倍型Hap19（n=1）和 Hap20（n=15），2个单倍型间存在5个碱基差异。ABGD聚类结果将Hap19单独列出为ABGD5。系统发育分析显示Hap19和Hap20与褐家鼠参考序列亲缘关系较近（BP=100）。Hap19和Hap20都与NCBI库中褐家鼠的参考序列最高相似性达到100%，因此Hap19和Hap20均属于褐家鼠。

综合形态鉴定和DNA条形码分析，可以明确本次在广东雷州共捕获到4种鼠，其中黑缘齿鼠22只，黄毛鼠1只，黄胸鼠52只，褐家鼠16只。不同鼠种的种间遗传距离均大于种内遗传距离，种间的遗传距离范围为6.86%～11.43%。黑缘齿鼠种内不同单倍型的平均遗传距离为1.09%，遗传距离范围为0.16%～2.39%，其中Hap9～Hap11与Hap6之间以及Hap10与Hap5之间的种间遗传距离大于2%，其余单倍型间的遗传距离均小于2%;黄胸鼠种内平均遗传距离为0.37%，遗传距离范围为0.16%～0.64%;褐家鼠种内两个单倍型间的遗传距离为0.80%。

2.2Vkorc1基因在捕获鼠的种间和种内变异情况

褐家鼠、黑缘齿鼠、黄毛鼠和黄胸鼠的Vkorc1基因编码区存在多个种间变异（表1）。以褐家鼠为参考，黑缘齿鼠与褐家鼠间存在3个沉默突变Arg12Arg、Ile107Ile、Thr137Thr和1个错义突变Ile90Leu;黄毛鼠与褐家鼠间存在5个沉默突变，分别为Arg12Arg、Ala41Ala、Arg98Arg、Ile107Ile和Thr137Thr;黄胸鼠与褐家鼠间存在3个沉默突变，分别为Arg12Arg、Ile107Ile和Thr137Thr和1个错义突变Ile90Leu。这些种间的Vkorc1变异可以为今后分析其中一个鼠种的种内Vkorc1变异是否掺入了种间变异提供参考。

分析每个鼠种种群内部的Vkorc1编码区变异发现（表1），16只褐家鼠中，15只携带沉默突变His68His，频率为93.8%，3只携带沉默突变Ile82Ile，频率为9.4%;在22只黑缘齿鼠中，18只携带沉默突变Ala18Ala，频率为59.1%;在52只黄胸鼠中，1只携带沉默突变Ala18Ala，频率为1.0%，2只携带沉默突变Ala41Ala，频率为1.9%。这些表明在褐家鼠、黑缘齿鼠和黄胸鼠的种内仅发现沉默突变，未发现可以导致氨基酸突变的错义突变。

3结论与讨论

本研究对黑缘齿鼠的11个COⅠ单倍型（Hap1～Hap11）进行系统进化分析时发现，11个单倍型与NCBI数据库中下载的黑家鼠海南亚种和黑家鼠滇西亚种以及黑缘齿鼠聚为一支（图1）。Lu等通过分析不同鼠种的细胞色素b和COⅠ序列，认为黑家鼠海南亚种和黑家鼠滇西亚种与黑缘齿鼠为同一物种［46］。通常认为以COⅠ为遗传标记时，同一物种的种内遗传距离小于2%［47］。本研究发现黑缘齿鼠大部分COⅠ单倍型之间的遗传距离小于2%，仅Hap6和Hap9～Hap11之间以及Hap5和Hap10之间的遗传距离大于2zyStY3W9ZldZk/qx2uNULw==%，说明黑缘齿鼠种群内部个别单倍型间出现了较大的遗传分化。ABGD聚类分析显示，褐家鼠的2个单倍型Hap19和Hap20分别位于不同的聚类单元，但系统进化分析和BLAST分析支持Hap19和Hap20均为褐家鼠，并且遗传距离分析显示褐家鼠种内遗传距离小于2%，因此Hap19和Hap20均应为褐家鼠。综合形态鉴定和DNA条形码鉴定，可以明确捕获鼠包含4个鼠种，分别为黑缘齿鼠、黄毛鼠、黄胸鼠和褐家鼠，其中黄胸鼠为优势种群，占比57.1%，黑缘齿鼠和褐家鼠占比分别为24.2%和17.6%，黄毛鼠占比最少，为1.1%。广东农区分布有褐家鼠、黄胸鼠、黑缘齿鼠、黄毛鼠、板齿鼠、大足鼠Rattus nitidus和小家鼠［2324］，由于采集时间、采集地点及采集方法的差异，不同鼠类调查的结果会存在一定的差异。例如，2017年12月广东省江门市农田捕获的鼠种主要是黄毛鼠（82.2%）和黄胸鼠（11.1%）［23］;2019年9月-2020年10月利用鼠类物联网智能监测系统监测到的主要鼠种为黄毛鼠（50.4%）、板齿鼠（22.0%）、小家鼠（16.0%），而利用夹夜法捕获的鼠种以黄毛鼠（71.7%）和小家鼠（16.9%）为主［24］。本研究在乌石镇采用笼捕法捕获的鼠种以黄胸鼠、黑缘齿鼠和褐家鼠为主，黄毛鼠比较少，可能是因为黄毛鼠在农田分布较多，而本次调查主要集中在农村居民区。

通过分析和比较4个鼠种种间的Vkorc1变异共发现了5个沉默突变和1个错义突变Ile90Leu（表1），这些突变可为鉴定不同鼠种种内的Vkorc1基因变异提供重要参考。如果这些种间的Vkorc1变异出现在种群内，则需要考虑是否可能存在物种鉴定错误或者种间杂交的情况［21，48］。例如，曾经在褐家鼠种群中报道的Vkorc1变异，包括Arg12Arg、Trp59Arg、Ile90Leu、Val112Leu、Ile141Val和Ala143Val等突变［9］，后来经过系统进化分析，发现这些变异并非褐家鼠种群内部的变异，而是由于一些黑家鼠被错误的鉴定为褐家鼠，导致一些种间的突变被误认为是种内的突变［21］;曾经在西欧小家鼠Mus musculus domesticus种群内报道的Vkorc1抗性变异Arg12Trp、Ala26Ser、Ala48Thr和Arg61Leu［9］，后来被鉴定是西欧小家鼠与阿尔及利亚鼠Mus spretus的种间变异，并且小家鼠可以通过与后者杂交获得后者的Vkorc1基因而获得抗性［48］。

黑缘齿鼠种群内存在1个沉默突变Ala18Ala，黄胸鼠种群内存在2个沉默突变Ala18Ala和Ala41Ala，褐家鼠种群内存在2个沉默突变His68His和Ile82Ile。沉默突变不改变VKOR蛋白酶的编码，对啮齿动物的抗药性影响较小［14］。本研究在乌石镇的黄胸鼠和褐家鼠的种群中，均没有检测到会导致氨基酸变异的错义突变，这说明雷州市乌石镇的黑缘齿鼠、黄胸鼠和褐家鼠对抗凝剂的抗性水平较低，第一代抗凝剂仍适用当地种群的防治。

广东雷州地区的鼠类抗性问题一直受到广泛的关注。雷州市奋勇华侨农场捕获的黄胸鼠抗性率为10.6%，褐家鼠未发现抗性鼠［29］;雷州半岛家栖鼠抗药性监测发现黄胸鼠的抗性率为7.9%，褐家鼠未发现抗性鼠［3］;雷州市郊黄胸鼠对杀鼠灵的抗性率为11.1%［49］;检测广东遂溪的黑家鼠海南亚种对杀鼠灵毒饵的抗性，未发现抗性个体［50］。本研究发现广东雷州的黄胸鼠、褐家鼠以及黑缘齿鼠的种群抗性水平均较低，与历史的生理抗性检测结果基本一致。一方面，虽然发现雷州地区的黄胸鼠种群中有抗性鼠，但一直表现为中低水平的抗性，没有形成明显的抗性种群（抗性率>15%），其原因可能是当地抗凝剂的选择压力有限。另一方面，Vkorc1抗性突变可以导致鼠类的抗药性，但小部分的抗性鼠不一定携带Vkorc1变异［51］。在敏感的褐家鼠种群中持续使用杀鼠灵3～5代后，Vkorc1基因没有发现任何变异，但5.7%～7.1%的褐家鼠可以通过LFP法检测表现为抗性鼠［52］，因此LFP抗性检测法与基于Vkorc1突变的抗性检测法检测出的抗性鼠频率可能存在小幅的差异。此外，鼠类抗药性种群的发生通常被认为是点状发生，而不是平均分布在整个区域［5354］。因此有可能雷州其他地区的鼠类出现了一定程度的抗性，但乌石镇的黄胸鼠仍对抗凝剂比较敏感。

广东省雷州市乌石镇农村居民区的优势鼠种是黄胸鼠，黑缘齿鼠和褐家鼠次之。这些鼠种对抗凝剂的抗药性水平较低，第一代抗凝剂例如杀鼠灵和敌鼠钠盐仍然可以有效地防治这些鼠类种群。

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（责任编辑：杨明丽）