葡萄孢属菌株 HY-021可湿性粉剂的制备及除草作用

摘要为了进一步明确葡萄孢属Botrytis菌株HY-021除草活性，采用单因素法筛选该菌株的最适固体发酵基质、适宜载体和助剂，制备可湿性粉剂，并进行盆栽接种评价其除草活性。结果表明：HY-021菌株最适生长的固态基质为玉米粉，最优配方组合为：麦秆糠14.5 g+麦麸19.4 g+菜籽饼1.5 g+玉米粉14.6 g。适宜的载体、稳定剂、分散剂、保护剂和润湿剂分别为高岭土、轻质碳酸钙、羧甲基纤维素钠、可溶性淀粉和十二烷基硫酸钠。菌株HY-021可湿性粉剂对苗期盆栽的藜、密花香薷、猪殃殃3种杂草有较好除草活性，其中对藜和猪殃殃表现出较强的致病性，致病率分别为85.83%、89.45%，鲜重防效分别为81.82%、87.16%。本试验制备的HY-021生防菌株可湿性粉剂，可作为生防菌剂有效控制藜和猪殃殃等杂草。

关键词葡萄孢属菌株HY-021;可湿性粉剂;除草作用

中图分类号：S 451.1文献标识码：ADOI：10.16688/j.zwbh.2023596Wettable powder preparation of Botrytis strain HY-021

and its herbicidal effectZHU Haixia，WANG Tianqi，CHENG Liang，CHENG Haiyang（Scientific Observing and Experimental Station of Crop Pests in Xining， Ministry of Agriculture and Rural Affairs，

Key Laboratory of Agricultural Integrated Pest Management in Qinghai Province， Academy of Agriculture and

Forestry Sciences of Qinghai University， Xining810016， China）AbstractIn order to clarify the herbicidal activity of the Botrytis strain HY-021， a wettable powder was prepared， and its herbicidal activity was measured. The single-factor method was used to screen the optimal solid fermentation substrate， suitable carrier， and auxiliary agent for the strain HY-021. A wettable powder was prepared and its herbicidal activity was evaluated by pot inoculation. The results showed that the most suitable solid substrate for the strain HY-021 to grow was corn flour， and the optimal formula combination was wheat straw bran 14.5 g， wheat bran 19.4 g， rapeseed cake 1.5 g， and maize flour 14.6 g. Kaolin， light calcium carbonate， carboxymethylcellulose sodium， soluble starch and sodium dodecyl sulfate were comprehensively selected as the carrier， stabilizer， dispersant， protector， and wetting agent of the strain HY-021. The wettable powder of the strain HY-021 exhibited good herbicidal activity against three kinds of weeds， namely Chenopodium album， Elsholtzia densa， and Galium spurium， at the seedling stage in pot tests. Among them， the HY-021 showed strong pathogenicity to C.album and G.spurium， with incidence rate of 85.83% and 89.45%， and fresh weight control effect of 81.82% and 87.16%， respectively. HY-021 wettable powder can be used as a biocontrol agent to effectively control weeds such as C.album and G.spurium.

Key wordsBotrytis strain HY-021;wettable powder;herbicidal effect杂草侵扰是降低作物产量的主要因素［1］，据估计，每年约有1 800种杂草对主要农作物产量带来不同程度的损害，难治的恶性杂草多达130余种，杂草侵害一般会导致主要粮食作物减产20%，严重时减产45%甚至颗粒无收［12］。我国杂草常年发生面积达0.933亿hm2次以上，形成草害的面积为0.51亿hm2次，平均减产9.7%，而实际生产中，因草害防控不利引起的作物减产远高于上述数字［3］。随着社会文明的发展和公众健康意识的提高，开发广谱、高效、低毒的新型生物除草技术和微生物除草剂已成为大势所趋。

生物除草剂利用丰富的杂草病原微生物资源，不仅能够无污染、无药害、有效地控制难除杂草种群，而且对目标杂草以外的植物影响小，环境负效应小，安全性高［46］。当前全球公布的商业化生物除草剂已有20多个产品［78］。微生物除草剂有益于生态结构的动态平衡而成为生态农业中防治草害的首选，成为一些化学农药的替代品［910］。在未来除草剂发展领域中，开发具有特色的生物除草剂、研发其商业化应用体系，具有广阔的应用前景［1112］。

葡萄孢属 Botrytis菌株HY-021分离自巴天酸模 Rumex patientia叶片，前期研究发现该菌株具有良好的除草活性，经鉴定确定为拟蚕豆葡萄孢Botrytis fabiopsis。为了安全、经济、有效地利用该菌株，充分发挥活体微生物的作用效果，扩大应用范围，本研究对适宜该菌株发酵的碳氮源、固体发酵基质及适宜载体和助剂进行筛选，研制该菌株的可湿性粉剂，并测定其除草活性。旨在为微生物剂型的研制提供理论依据，并为杂草生防菌的进一步田间应用奠定基础。

1材料与方法

1.1供试材料

葡萄孢属 Botrytis菌株HY-021分离自巴天酸模 Rumex patientia L叶片，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.40557。

1.2试验方法

1.2.1固态发酵基质的单因素筛选及正交组合设计将菌株HY-021活化后接种于PDB培养液中，180 r/min振荡培养5 d，将获得的发酵液稀释为孢子浓度为1×108个/mL的种子液备用。选取廉价农副产品玉米粉、麦秆糠、羊粪、菜籽饼、麦麸作为发酵培养的基本材料，每25 g固态基质接种5 mL种子液，将其置于25℃生化培养箱中黑暗静置培养10 d后取出，自然烘干并粉碎，对不同基质下HY-021的产孢量进行测定［13］。同时用分光光度计测其OD600，筛选出最适合HY-021生长的固体基质，每处理重复3次。

根据5种单一基质发酵初步筛选结果，选取麦麸、麦秆糠、菜籽饼、玉米粉为4个基本组分因子，通过正交设计得到9个配方（表1），配制成9种固体基质培养基，在配制好的9种固态发酵基质中，按2%（质量分数）的比例加入肌醇作为碳源，硫酸铵作为氮源，然后加入适量的无菌水，混合均匀后，分别装入250 mL的锥形瓶中，密封后于121℃下高压灭菌30 min，待自然冷却后，每瓶接入10 mL孢子浓度为1×108 个/mL的种子液，搅拌均匀，再次密封;以单一基质为对照，对其进行发酵培养、洗脱并收集分生孢子，并统计产孢量和OD600。

1.2.2载体和助剂的筛选

在所筛选出的HY-021菌株最适培养基上，分别以2%（质量分数）的量加入载体（高岭土、石灰石、硅藻土、拉开粉、黏土）、分散剂（吐温、羧甲基纤维素、木质素磺酸钠、羧甲基纤维素钠、十二烷基磺酸钠、聚乙烯醇）、稳定剂（轻质碳酸钙、重质碳酸钙、膨润土、白炭黑）、保护剂（腐殖酸、海藻酸钠、糊精、可溶性淀粉）和润湿剂（十二烷基硫酸钠、拉开粉）制成含不同载体和助剂的培养基，然后分别接入直径为8 mm的菌饼，观察HY-021在含有不同载体助剂的培养基上的生长状况，筛选出适宜的载体、稳定剂、润湿剂、分散剂及其他助剂。

1.2.3HY-021可湿性粉剂的初步制备

按1.2.1的方法制备菌株HY-021种子液，以优化后的最适基质为发酵基质，加入2%的最适碳、氮源，在25℃黑暗条件下培养10 d。获得的固体发酵物干燥、粉碎，制得菌粉。将菌粉与筛选出的适宜载体、助剂，按照50%载体、6%分散剂、1%稳定剂和3%润湿剂的比例混合，粉碎，混合，再粉碎，室温下自然干燥，制成可湿性粉剂［12，14］。

1.2.4HY-021可湿性粉剂对盆栽杂草致病性测定

将田间健康生长的藜Chenopodium album、猪殃殃Galium spurium、密花香薷Elsholtzia densa幼苗移栽至d=15 cm的花盆中，每盆8株，3次重复，于温室内培养。将制作好的可湿性粉剂溶解后，使用双层无菌纱布过滤，将所得滤液使用喷雾法连续2 d接种至正常生长的4～6叶期的健康盆栽植株上，每盆接种量为25 mL。接种后的杂草植株套袋保湿24 h，置于25～30℃、光周期L∥D=12 h∥12 h条件下培养，每个处理设置3次重复，以接种清水作为空白对照。7 d后观察接种植株发病情况并计算发病率、鲜重防效［14］。

发病率=（发病植株数/调查植株总数）×100%;

鲜重防效=（对照鲜重-处理鲜重）/对照鲜重×100%。

1.3数据整理与统计分析

采用Excel 2016、SPSS 26.0对试验数据进行统计分析，并使用单因素方差分析（ANOVA）和最小显著差数法（LSD）对均值进行差异显著性检验。

2结果与分析

2.1固态发酵基质的单因素筛选及正交组合优化结果由朗伯比尔定律可知［15］，孢子悬液中的孢子量与OD600之间存在着正比关系，孢子悬液浓度的大小反映了产孢量多少。

从表2可以看出，HY-021在不同发酵基质上的产孢量存在显著差异。在等量发酵基质和种子液接入量相同的前提下，HY-021在玉米粉基质上生长旺盛，产孢量为1.25×1011个/mL，显著大于其他处理，其次为麦麸、菜籽饼。正交组合优化固体基质发酵配方结果显示，菌株HY-021在组合3（麦秆糠14.5 g+麦麸19.4 g+菜籽饼1.5 g+玉米粉14.6 g）中生长良好，产孢量显著高于其他组合（表3）。

2.2HY-021可湿性粉剂载体和助剂的筛选

从图1和表4可以看出，添加不同的载体和助剂后，菌株HY-021的菌落直径和孢子液OD600存在不同程度的差异。加入载体高岭土后，平均OD600是0.42， 6 d时的菌落直径为8.47 cm，菌落生长速率最快。加入稳定剂轻质碳酸钙后，OD600平均值为0.30，6 d时菌落直径达到8.35 cm;加入分散剂羧甲基纤维素钠后，OD600平均值为0.31，6 d时菌落直径达到8.33 cm;添加保护剂可溶性淀粉后，OD600平均值为0.37，6 d时菌落直径到达8.43 cm。在含有拉开粉的培养基上，菌株生长完全被抑制。结合菌株生长情况和原料成本，选择高岭土、轻质碳酸钙、羧甲基纤维素钠、可溶性淀粉和十二烷基硫酸钠分别作为HY-021的载体、稳定剂、分散剂、保护剂和润湿剂。

2.3HY-021可湿性粉剂的初步制备

在上述固态发酵基质配方优化中得出最适HY-021菌生长的最优基质配比，进行批量固体发酵，HY-021菌株在此配比下白色菌丝生成旺盛，生长10 d后，将生长良好的菌株自然晾干，粉碎成菌粉与筛选出的适宜载体、助剂，按照50%的载体、6%的分散剂、1%稳定剂和3%的润湿剂的比例混合制成可湿性粉剂，保存在4℃冰箱备用。

2.4HY-021可湿性粉剂对盆栽杂草的致病性

如表5和图2所示，喷施HY-021可湿性粉剂7 d后，对猪殃殃和藜的防治效果突出。对猪殃殃致病率和鲜重防效分别为89.45%和87.16%，植株叶片产生黑色病斑，逐渐褪绿成黑褐色，发病严重的植株枯死;对藜的致病率和鲜重防效达到85.83%和81.62%，植株表现为发黄、干枯萎蔫，直至整株枯死;对密花香薷的致病率和鲜重防效分别为58.89%和59.94%，植株表现为叶片出现大面积病斑，植株矮化。

3结论与讨论

与化学农药的开发相比，微生物除草剂的开发难度要大得多，因为它的药效会受到外部环境的影响，因此，选择适当的剂型以及载体助剂来维持菌剂的稳定性和侵染活力对成功开发生物农药非常关键［16］。庄超［17］将秸秆粉与齐整小核菌Sclerotium rolfsii菌丝混合制成固体颗粒剂型，在10、20、30、40 kg/667m2 4个处理剂量下，对一枝黄花Solidago decurrens幼苗7 d的株防效为85%～100%。Zhang等［18］将羧甲基纤维素和葡萄糖等助剂添加到凸脐蠕孢Exserohilum的孢子粉中，对稗草Echinochloa crus-galli的防除效果达90%以上。

近年来，生防菌在工业化生产中主要依赖于大型发酵装置的大规模繁殖与生产［19］。但在生产过程中，难以产生繁殖体、产孢量低、孢子致病力较差、或在经过多代繁殖后菌株的致病力下降，这些问题都阻碍生防真菌的规模化生产和商品化。在真菌除草剂的开发过程中，合适的载体和助剂能够促进并调控真菌孢子萌发，提高其致病性，同时降低环境限制，从而提高防治效果［20］。本研究以产孢量和OD600作为考察指标，确定适合HY-021生长的最适固态发酵基质，随后设计正交试验筛选出适合其生长的最佳基质配方组合，继而对HY-021的适宜载体和助剂进行了筛选，最后完成HY-021可湿性粉剂的初步研制。试验结果表明：HY-021最适生长的固态基质为玉米粉，且最优基质组合为麦秆糠14.5 g+麦麸19.4 g+菜籽饼1.5 g+玉米粉14.6 g，根据菌株生长状况并综合考虑孢子悬浮液浓度，选择高岭土、羧甲基纤维素钠、轻质碳酸钙、可溶性淀粉和十二烷基硫酸钠分别作为HY-021的载体、分散剂、稳定剂、保护剂和润湿剂。

本试验中利用初步制备的HY-021可湿性粉剂进行了盆栽杂草致病性测定，结果表明，HY-021可湿性粉剂对藜、密花香薷、猪殃殃3种杂草具有较好的除草活性，其中对藜和猪殃殃表现出较强的致病性，致病率分别为85.83%、89.45%。因此，该菌株有望成为田间防除藜、密花香薷、猪殃殃等杂草的生物除草剂，可配合使用其他生物菌剂或低量化学除草剂，应用于农田防除杂草。

杂草生防菌剂需对目标杂草有较强的致病性，同时又要保证其稳定性［13］。由于微生物细胞自身的生理特性，无法有效解决细胞在常温下长时间保存的技术瓶颈问题，导致发酵基质的固体剂型无法像化学除草剂那样长时间保存，相对于化学除草剂存在明显的劣势。因此，未来还需要探索出一种可以延长其货架寿命，同时提高其对不良环境抵抗力的方法，如加强对不同微生物，微生物菌剂与减量除草剂复配的研究力度，从而为杂草生防菌的田间应用打下更坚实的基础［12］。

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（责任编辑：杨明丽）