链霉菌YC117对烟草黑胫病的防控及活性物质稳定性研究

摘要为明确链霉菌YC117对烟草黑胫病的防控效果及活性物质的稳定性，通过形态学、生理生化特征及16S rRNA基因序列测定等方法对该菌株进行鉴定，并测定了链霉菌YC117的抑菌谱、对烟草疫霉菌丝形态的影响、发酵液的稳定性及盆栽防效。菌株YC117经鉴定确定为娄彻氏链霉菌Streptomyces rochei，具有很好的广谱抑菌活性，该菌株或其分泌物能够破坏烟草疫霉菌丝的形态结构，使菌丝出现断裂、干瘪、堆积，分枝增多和大小不一，细胞壁受损等现象。YC117菌剂在稀释100倍和200倍浓度下对烟草黑胫病的盆栽防效分别为61.54%和50.77%。发酵产生的抑菌活性物质对酸碱和热处理表现出较好的稳定性，但是对紫外照射比较敏感，紫外光照射20 min后，抑制率下降至9.52%。链霉菌YC117为防控烟草黑胫病生防制剂的开发提供了理论支持，具有较好的生防应用前景。

关键词娄彻氏链霉菌YC117;烟草黑胫病;鉴定;抑菌活性;稳定性

中图分类号：S 435.72文献标识码：ADOI：10.16688/j.zwbh.2023588Control efficacy of Streptomyces YC117 against tobacco black shank

disease and the stability of its active substancesYAO Jingwu ZHAO Yanan LI Yanyan WANG Hancheng YUAN Qinfeng YANG Dan

HUANG Daye CAO Chunxia（1. Hubei Biopesticide Engineering Research Center， National Biopesticide Engineering Research Center，

Wuhan430064， China; 2. Huazhong Agricultural University， Wuhan430070， China; 3. Hubei Academy of

Tobacco Science， Wuhan430030， China; 4. Guizhou Academy of Tobacco Science， Guiyang550081， China）AbstractTo clarify the efficacy of Streptomyces YC117 in controlling tobacco black shank disease and the stability of its active substances， the strain was identified based on morphological， physiological， and biochemical characteristics， and 16S rRNA gene sequencing. The antibacterial spectrum of Streptomyces YC117 was measured， its effect on mycelium morphology of Phytophthora nicotianae was observed， and the stability of its fermentation broth was explored. In addition， its effectiveness in preventing disease in potted plants was determined. The results showed that strain YC117 was identified as Streptomyces rochei. Streptomyces YC117 exhibited broad-spectrum antibacterial activity， disrupting the morphological structure of P.nicotianae hyphae by causing fragmentation， shrinkage， increased branching， and damage to the cell wall. The potted plant experiments demonstrated control effect of 61.54% and 50.77% against tobacco black shank disease at dilutions of 100 and 200 times， respectively. The antibacterial active substances produced by fermentation showed good stability under acid and basic conditions as well as heat treatment， but they exhibited sensitivity to UV irradiation. After 20 minutes of UV irradiation， the inhibition rate decreased to 9.52%. Streptomyces YC117 holds promise for the development of biocontrol agents against tobacco black shank disease， providing foundational support for biocontrol applications.

Key wordsStreptomyces rochei YC117;tobacco black shank disease;identification;antibacterial activity;stability由烟草疫霉Phytophthora nicotianae引起的烟草黑胫病是烟草上具有毁灭性的土传真菌病害，该病害在烟草的整个生育期均可发生，其中以大田期发病为主，危害部位主要为烟草根茎部，其田间发病率在15%左右，严重时达75%，甚至绝收，我国每年因该病造成的经济损失高达1亿元以上［14］。化学农药防治具有高效、便捷、迅速的特点，是目前防治烟草黑胫病的主要手段，但是大量施用不仅会对人类和环境造成危害，还会使烟草黑胫病菌抗性增加，防治效果降低［1］。胡燕等［5］测定了烯酰吗啉对烟草黑胫病菌继代培养物的毒力，发现烟草黑胫病菌对烯酰吗啉的抗性随培养代数增加而增加。彭丽娟等［6］发现，贵州省大部分地区的烟草黑胫病菌对甲霜灵的敏感性降低，抗性增加，建议轮换或停止施用甲霜灵。

放线菌在土壤中分布广泛且数量众多，约占土壤微生物群落的10%～50%，可以产生许多具有生物活性的次生代谢产物，在生物防治植物病害方面具有重要地位［7］。目前，已有不少学者开展了新型链霉菌及其抑菌活性产物的相关研究。Chen等［8］通过盆栽防效试验发现链霉菌FT05W和ZEA17I对烟草黑胫病菌具有较好的抑制作用，抑制率分别为68.82% 和76.18%。张潜等［9］通过盆栽试验发现，链霉菌Sa-21菌株发酵液对苗期和成株期烟草黑胫病有较好的抑制效果，相对防效分别为96.41%和98.39%。邹朔飞等［10］经过对峙培养试验和田间防效试验，筛选得到一株郝氏链霉菌Streptomyces halstedii MT35，其对烟草黑胫病菌有良好的抑菌效果，抑制率和防治效果分别为88.46%和75.3%。黄大跃［3］分离、筛选和鉴定到了一株链霉菌F-7，该菌株及其发酵液对烟草黑胫病菌菌丝的生长均有较强的抑菌活性，抑制率分别为75%和81.41%。

在研发新型生物制剂时，除关注菌株的抑菌活性外，还需考虑其抑菌活性物质的稳定性、贮藏、生产等条件。但是目前对于链霉菌产生的抑菌活性物质的稳定性报道相对较少，为进一步扩大链霉菌资源的开发利用，本实验室前期从烟草植株根际分离出一株对烟草疫霉具有拮抗作用的链霉菌菌株YC117，本研究通过形态学、生理生化特征及16S rRNA基因序列测定等方法对该菌株进行鉴定，研究链霉菌YC117的抑菌谱、对烟草疫霉菌丝形态的影响、发酵代谢液的稳定性和盆栽防效，以期为烟草黑胫病的防治提供参考，也为后期该菌株生物制剂的开发利用提供理论基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1供试菌株

供试菌株：Streptomyces YC117，由湖北省农业科学院湖北省生物农药工程研究中心筛选获得并保藏，CCTCC No： M20211692。

供试病原真菌：烟草黑胫病菌（烟草疫霉）Phytophthora nicotianae，烟草赤星病菌Alternaria alternata，水稻纹枯病菌Rhizoctonia solani，草莓灰霉病菌Botrytis cinerea，辣椒疫病菌Phytophthora capsici，枸杞根腐病菌Fusarium solani，番茄棒孢叶斑病菌Corynespora cassiicola，茶轮斑病菌Pestalotiopsis theae，生菜菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum，烟草根腐病菌Fusarium oxysporum，烟草炭疽病菌Colletotrichum destructivum，棉花黄萎病菌Verticillium dahliae等12种病原真菌均由湖北省生物农药工程研究中心提供。

1.1.2供试培养基

V8培养基：V8汁220 mL，碳酸钙2 g，琼脂18 g，蒸馏水1 000 mL;种子培养基：甘露醇20 g，大豆蛋白胨10 g，碳酸钙0.5 g，磷酸氢二钾0.35 g，蒸馏水1 000 mL;发酵培养基：可溶性淀粉10 g，葡萄糖10 g，棉籽粉25 g，酵母粉3 g，碳酸钙5 g，氯化钠2 g，蒸馏水1 000 mL;其他培养基包括高氏1号固/液体培养基、PDA培养基和ISP2培养基［10］。

1.1.3供试微生物菌剂及烟草品种

109 cfu/g枯草芽胞杆菌微囊粒剂由成都特普生物科技股份有限公司生产。供试烟草品种为‘云烟87’。

1.2菌株YC117的抑菌谱测定

参照单宇航［11］的平板对峙培养法对菌株YC117进行抑菌谱测定。打取直径4 mm的YC117菌饼置于PDA平板中心两侧，相距4 cm，于28℃培养箱预培养48 h后，在中心处接直径4 mm病原菌菌饼，对照组为PDA平板中央仅接病原菌，每个处理重复3次，于25～28℃培养箱培养5～10 d，十字交叉法测量菌落直径并计算抑制率。

抑制率=（对照组菌落直径-处理组菌落直径）/对照组菌落直径×100%。

1.3链霉菌YC117的鉴定

1.3.1形态学和生理生化鉴定

用接种环刮取菌株YC117在ISP2平板上划线，28℃培养箱倒置培养7 d，观察菌落形态特征，并参考《常见细菌系统鉴定手册》等对菌株进行生理生化特性测定［1213］。

1.3.216S rRNA基因序列分析

采用天根细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株YC117的DNA。以引物27F：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′和1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′对菌株YC117的16S rRNA基因序列进行扩增［14］。扩增程序：94℃预变性3 min;94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，32个循环;72℃延伸5 min;12℃保温5 min。产物经1.2%琼脂糖电泳检测后送湖北擎科生物科技有限公司测序。将测序结果上传至NCBI进行同源序列比对，并利用MEGA 7.0软件的neighbor-joining法构建菌株YC117的系统发育树。

1.4链霉菌YC117对烟草疫霉菌丝形态的影响

1.4.1光学显微镜观察

结合1.2平板对峙培养法，在接菌之前先铺设灭菌的玻璃纸，再接链霉菌YC117和烟草疫霉菌饼，对照组为只接种烟草疫霉，密封后放于28℃培养箱对峙培养5 d，将对峙培养和对照组边缘的烟草疫霉菌丝块切下，置于光学显微镜下观察烟草疫霉菌丝形态的变化并拍照。

1.4.2扫描电镜观察

参照胡春辉等［15］扫描电镜生物样本的制备方法，重复1.4.1的取样操作，在扫描电镜下观察烟草疫霉菌丝形态并拍照。

1.5链霉菌YC117对烟草黑胫病的盆栽防效测定

1.5.1链霉菌YC117菌剂的制备

参考王静等［16］制备发酵液的方法，刮取斜面上生长良好的链霉菌YC117于ISP2培养基上均匀划线后，于28℃培养箱培养7 d。用直径4 mm的打孔器打取1块菌饼接种于种子培养基，每500 mL三角瓶内装液量为200 mL，于28℃、150 r/min振荡培养3 d，即得YC117种子液。以10%的接种量将链霉菌YC117种子液接于发酵培养基中，每2.5 L三角瓶内装液量为500 mL，于28℃、150 r/min振荡培养7 d，即得YC117发酵液。将YC117发酵液与无菌的珍珠岩按4∶1拌均匀，待其风干后使用粉碎机打碎成粉剂，稀释计数得到菌浓度为1.29×108 cfu/g的YC117菌剂，备用。

1.5.2烟草疫霉菌悬液的制备

将斜面上活化好的烟草疫霉菌饼接于V8产孢培养基上，密封后光照培养14 d，用无菌水处理后刮取V8培养基上的烟草疫霉菌丝，4℃下放置20 min，之后室温放置20 min，使其释放游动孢子，经无菌纱布过滤除杂后，稀释即得1×106cfu/mL烟草疫霉菌悬液，备用。

1.5.3链霉菌YC117防控烟草黑胫病试验

参照王万能等［17］培育烟苗的方法，于26～28℃温室中光照培养，待‘云烟87’出苗后移栽。在烟苗长至6～7片叶时挑选长势一致的烟苗随机分成4组，即CK：清水，T1：YC117菌剂与水的比例为1 g∶100 mL（稀释100倍），T2：YC117菌剂与水的比例为1 g∶200 mL（稀释200倍），T3：1亿cfu/g枯草芽胞杆菌与水的比例为1 g∶300 mL（稀释300倍），每处理3个重复，每重复12株烟苗。YC117菌剂、枯草芽胞杆菌和烟草疫霉接种方法均采用刺伤灌根接种。共施药两次，每次20 mL/钵，CK施等量清水;第2次施药与第1次间隔3 d，在第2次施药后3 d，接烟草疫霉菌悬液，5 mL/钵。于接种后15 d开始调查并记录烟苗发病情况，计算病情指数及防治效果。

烟草黑胫病的分级参照中华人民共和国烟草行业标准—烟草病虫害分级及调查方法（GB/T 23222-2008）：0级，全株无病;1级，茎部病斑不超过茎围的1/3或1/3以下叶片凋萎;3级，茎部病斑环绕茎围1/3至1/2或1/3至1/2叶片轻度凋萎，或下部少数叶片出现病斑;5级，茎部病斑超过茎围的1/2，但未全部环绕茎围或1/2至2/3叶片凋萎;7级，茎部病斑全部环绕茎围或2/3以上叶片凋萎;9级，病株基本死亡［18］。

发病率=发病株数/调查总株数×100%;

病情指数=∑（病级值×该级病株数）/（病级最高值×调查总株数）×100;

防效=（对照组病情指数-处理组病情指数）/对照组病情指数×100%。

1.6链霉菌YC117发酵液抑菌活性物质稳定性测定1.6.1链霉菌YC117无菌发酵液的制备

将链霉菌YC117在高氏1号固体培养基上活化，放于28℃培养箱培养7 d，用直径4 mm的打孔器打取1块菌饼于高氏一号液体培养基中，于28℃、150 r/min振荡培养3 d，为链霉菌YC117种子液。将链霉菌YC117的种子液以6%的接种量接于高氏一号液体培养基中，于28℃、150 r/min振荡培养6 d，得到链霉菌YC117的基础培养液。将YC117的基础培养液在11 000 r/min下离心10 min，取其上清液，过直径0.22 μm的微孔滤膜，即为链霉菌YC117的无菌发酵液，备用。

1.6.2链霉菌YC117发酵液的稳定性测定

1.6.2.1酸碱稳定性试验

采用1.0 mol/L的HCl溶液和1.0 mol/L的NaOH溶液调节链霉菌YC117发酵液的pH值，分别调至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0，将不同pH的发酵液于室温下静置30 min后，再将pH调至7.0，离心后用0.22 μm的微孔滤膜过滤制备不同pH下处理的无菌发酵液，采用生长速率法检测其抑菌活性。

1.6.2.2热稳定性试验

将链霉菌YC117无菌发酵液置于装液量10 mL/15 mL的离心管中，再分别置于40、50、60、70、80、90、100℃的水浴锅中，水浴处理时间为30 min，取出后于室温下冷却，以未经热处理的无菌发酵液为对照，检测其抑菌活性。

1.6.2.3紫外照射稳定性试验

取10 mL链霉菌YC117无菌发酵液于直径60 mm的培养皿中，开盖后置于磁力搅拌器上，将其放置在距离紫外灯管（UV-C， 45W）垂直25 cm处，照射时间分别为0、1、2、3、4、5、10、15 min和20 min，其中以照射时间0 min为对照，进行抑菌活性测定。

1.7数据统计与分析

使用SPSS 26和Excel 2016统计软件进行数据分析和作图。

2结果与分析

2.1链霉菌YC117的抑菌谱

菌株YC117对除烟草根腐病菌外的11种供试病原菌均具有一定的抑菌活性（表1）。其中，对烟草黑胫病菌（图1i）、辣椒疫病菌（图1f）、生菜菌核病菌（图1b）的生长抑制作用非常明显，抑制率分别高达92.94%、90.20%和85.49%。对茶轮斑病菌、烟草炭疽病菌、草莓灰霉病菌、烟草赤星病菌的抑制率也均在60%以上。表明菌株YC117的抑菌谱比较广。

2.2链霉菌YC117的鉴定

2.2.1形态学特征及生理生化特性

菌株YC117形态学鉴定结果见图2，YC117在ISP2培养基上培养7 d后菌落形状呈无规则圆形，中央有灰白色褶皱状凸起，边缘有白色放射状菌丝，基内菌丝黄色，可溶性色素黄色;在100倍和1 000倍显微镜下观察到孢子丝直或柔曲，孢子椭圆形。

如表2所示，菌株YC117能够利用D-果糖、D-山梨醇、D-半乳糖、D-麦芽糖、蔗糖等多种碳源，但是不能利用D-乳糖;可以较好地利用D-天冬氨酸、D-丝氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸、L-丙氨酸和L-谷氨酸，但对L-焦谷氨酸的反应结果为阴性;菌株YC117有耐盐性，在NaCl含量为8%的培养基上可以生长。参考《常见细菌系统鉴定手册》和《放线菌的分类和鉴定》，综合分析菌株YC117的形态特征及生理生化特性，初步确定该菌株属于链霉菌属Streptomyces。

2.2.2链霉菌YC117的分子生物学鉴定

将菌株YC117 16S rRNA基因序列在NCBI数据库中与已有序列进行BLAST比对，通过MEGA 7.0软件以neighbor-joining法构建系统发育树（图3），发现该菌株与Streptomyces rochei 173342共聚一支，相似性达100%。综上，经形态学鉴定、生理生化特性和分子鉴定结果，将菌株YC1171鉴定为娄彻氏链霉菌Streptomyces rochei。

2.3链霉菌YC117对烟草疫霉菌丝形态的影响

通过光学显微镜可以观察到对照组的烟草疫霉菌丝细长、大小均匀、表面光滑、分枝正常;而与菌株YC117对峙培养后，处理组烟草疫霉菌丝膨大增多，菌丝畸形严重、分枝增多而短小（图4）。

经扫描电镜观察，正常生长的烟草疫霉菌丝形态饱满、圆润，粗细均匀，分枝正常（图5a），而平板对峙培养中受抑制菌落边缘的菌丝形态与对照相比发生很大的变化，菌丝皱缩干瘪、堆积、粗细不均，部分菌丝对折生长（图5b），细胞壁受损明显，菌丝分枝增多（图5c），表明YC117菌株或其分泌物能够破坏烟草疫霉菌丝的形态结构，对其生长产生不利影响。

2.4链霉菌YC117对烟草黑胫病的盆栽防效

菌株YC117对烟草黑胫病的盆栽防控效果如表3所示，与CK相比，菌株YC117菌剂稀释100倍、200倍处理和枯草芽胞杆菌稀释300倍处理均能有效地防治烟草黑胫病，其防治效果分别为61.54%、50.77%和76.92%，烟草病情指数分别降低了61.5%、50.8%和76.9%，发病率也分别降低了44.44、41.67百分点和55.55百分点（表3）。说明，菌株YC117对烟草黑胫病具有良好的防治效果。

2.5链霉菌YC117的抑菌活性物质的稳定性

2.5.1酸碱稳定性

将经过不wwWS1ikGLgwFjll9rZwgMg==同pH处理得到的链霉菌YC117无菌发酵液与烟草疫霉做对峙试验，结果见图6。菌株YC117发酵液在pH 8时抑菌活性最大，抑制率为60%，说明抑菌活性物质在弱碱性条件下稳定性比较好;当pH为 4和10时，抑制率分别为54.32%和51.60%;当发酵液处于强酸、强碱，即pH 2和12时，抑制率分别为49.63%和47.16%，说明在强酸、强碱环境中，菌株YC117发酵产生的抑菌物质仍具有较高的抑菌活性，这可能是因为其发酵液中存在或者产生了一些酸碱缓冲物质，使抑菌活性物质对酸碱变化影响具有很好的稳定性。

2.5.2热稳定性

由图7可知，菌株YC117发酵液中抑菌活性物质的抑菌活性随着温度上升而逐渐降低。当处理温度为40℃时，抑菌活性表现最好，对烟草疫霉的抑制率为61.90%;当处理温度低于60℃时，其抑菌活性与对照相当;当温度处于100℃时，菌株YC117发酵液中抑菌活性物质仍具有较高的抑菌活性，抑制率为52.41%。说明菌株YC117产生的抑菌活性物质具有较好的热稳定性。

2.5.3紫外光照射稳定性

由图8可见，与未经紫外光照射组的菌株YC117发酵液相比，经紫外光照射后的无菌发酵液对烟草疫霉的抑制作用明显降低。当紫外光照射1 min，抑制率降至35.59%;照射5 min，抑制率降至25.31%;照射20 min，抑制率下降至9.52%。说明该抑菌活性物质对紫外光照射比较敏感，稳定性不高。

以上结果表明，链霉菌YC117发酵液抑菌活性物质对强酸（pH=2）和强碱（pH=12）的耐受性、稳定性都很高，弱碱（pH=8）条件下抑菌活性最高，但对60℃以上高温比较敏感，紫外光照射1 min后抑菌活性开始明显降低，照射20 min后抑菌活性几乎丧失。

3结论与讨论

在植物病害生物防治中，链霉菌属是一类具有经济价值和开发价值的微生物，是生物制剂研发的重要来源［14］。经过形态学、生理生化特征及16S rRNA基因序列测定等方法鉴定菌株YC117为娄彻氏链霉菌Streptomyces rochei，该菌株具有广谱抑菌活性，对11种供试病原真菌有较强的抑菌效果，其中对烟草黑胫病菌的拮抗效果最好，抑制率达92.94%。在盆栽防效试验中，链霉菌YC117菌剂稀释100倍处理后对烟草黑胫病有较好的防治效果，防治效果达61.54%，表明该菌株具有良好的应用潜力和使用价值。通过对峙培养法观察发现，链霉菌YC117能够破坏烟草疫霉菌丝的形态结构，使菌丝出现断裂、干瘪、堆积，分枝增多和粗细不均，细胞膜受损等现象，这与张潜等［9］的研究结果一致，可能是链霉菌YC117分泌的某些溶解病原细胞壁的酶的作用结果，通过破坏烟草疫霉菌丝的生理结构，进而对烟草疫霉菌丝的生长表现出抑制作用;黄宁珍等［19］的研究还发现，抗病活性物质可能主要为蛋白质类化合物， 除此外还有一些非蛋白因子能抑制烟草疫霉菌丝生长;覃可等［20］也发现链霉菌FT05W能产生多种有益次生代谢产物和酶，对烟草黑胫病有良好的拮抗作用，对于生物防治烟草黑胫病提供一定的科学依据。

生防制剂的研发不仅要考虑抑菌效果，还要考虑抑菌活性物质的稳定性、生产的安全性、储运的便捷性、适用的广泛性等问题［21］。在自然条件下使用时，拮抗微生物产生的抑菌物质常受到温度、光照、土壤pH等条件的影响。目前，对于链霉菌代谢产物稳定性的研究报道相对较少。吕昂等［22］测定了链霉菌3-10发酵液的提取物对80℃以上的高温、碱性（pH8～13）环境和紫外线照射比较敏感，紫外线照射20 min对病菌抑制率下降至9.7%。赖宝春等［23］报道了小串链霉菌Streptomyces catenulae XG40发酵液的抑菌物质比较耐酸碱和紫外线照射，但高温对其抑菌活性影响较大。范万泽等［24］报道了娄彻氏链霉菌ZZ-9发酵液代谢产物耐高温（100℃）， 对强酸（pH 2）和强碱（pH 12）处理、长时间（16 h）可见光及紫外线照射均有较好的稳定性。张雨阳等［25］报道了链霉菌15-6发酵液抑菌物质在温度和紫外线照射处理条件下有较好的稳定性，但是对酸性（pH 1～6）或碱性（pH 8～13）条件很敏感。本研究结果与前人研究结果不尽相同，链霉菌YC117发酵产生的抑菌活性物质对酸碱有较好的稳定性，在40℃、pH 8处理30 min时，抑菌活性最高，当温度低于60℃时对抑菌活性有促进作用，但是对60℃以上高温和紫外照射比较敏感，紫外光照射20 min后，抑制率下降至9.52%。

本研究为烟草黑胫病及其他植物病害的防治提供了一定的科学依据，也为后期链霉菌YC117的田间应用及菌剂研发奠定了基础。此外，本研究中链霉菌YC117对各供试病原真菌的测试、防效试验及稳定性试验均为室内测定，在大田环境中的抑菌效果仍需进一步验证。

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（责任编辑：杨明丽）