新加苁蓉菟丝汤通过线粒体自噬途径促卵泡发育的分子机制

摘要：基于液相色谱-质谱联用仪（LC-MS）技术、网络药理学和动物实验探讨新加苁蓉菟丝汤（XJCRTST）通过颗粒细胞线粒体自噬途径促卵泡发育的分子生物学机制。通过LC-MS和网络药理学筛选出XJCRTST的主要成分、其治疗卵巢功能减退疾病靶点及通路。选取雌性SD大鼠分为模型组，西药组，XJCRTST高、中、低剂量组共5组。HE染色观测卵巢形态学变化；透射电镜观察卵巢颗粒细胞中线粒体结构形态及线粒体自噬体。结果表明，LC-MS技术鉴定出XJCRTST化合物共252个，其治疗卵巢功能减退类疾病潜在作用靶点42个，GO功能富集过程中主要涉及BP（1 168项）、CC（45项）和MF（59项），KEGG通路富集显示参与的通路有AGE-RAGE、Prolactin及TNF信号通路等，Mitophagy-animal过程中共富集了3个靶基因：Parkin/PINK1、HIF1A、MAPK8。动物实验表明，中药治疗组大鼠卵泡数量增多，闭锁卵泡减少。电镜观察中发现中药组线粒体肿胀减轻、线粒体自噬情况减少。综上得出XJCRTST治疗卵巢功能减退可能通过调节卵巢颗粒细胞中线粒体功能和线粒体自噬相关通路发挥其治疗作用。

关键词：新加苁蓉菟丝汤；卵巢功能减退；网络药理学；液相色谱-质谱联用仪；线粒体

中图分类号：R282文献标志码：A文章编号：1002-4026（2024）05-0025-10

开放科学（资源服务）标志码（OSID）：

The molecular mechanisms by which Xinjia Cistanche Tusi Decoction

promotes follicular development through mitophagy

YAN Jin1， LI Fei2*， WU Keming3，YANG Haobo1

（1. School of Basic Medicine， Shaanxi University of Chinese Medicine， Xianyang 712000， China; 2. Affiliated Hospital of

Shaanxi University of Chinese Medicine， Xianyang 712000， China; 3. Affiliated Hospital of

Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 610000， China）

Abstract∶Using light chromatography-mass spectrometry （LC-MS）， network pharmacology， and animal experiments， we explored the molecular mechanism by which Xinjia Cistanche Tusi Decoction （XJCRTST） promotes follicular development through granulosa cell mitophagy. LC-MS and network pharmacology were used to screen for the main components of XJCRTST and its therapeutic targets and pathways related to hypoovarianism. Female Sprague-Dawley rats were divided into five groups： model group， western medicine group， and XJCRTST high dose， medium dose， and low dose groups. The morphological changes of the ovary were observed through hematoxylin and eosin staining， and the structure and morphology of mitochondria and mitophagosomes in ovarian granulosa cells were observed through transmission electron microscopy. Two hundred and fifty-two compounds were identified in XJCRTST， with 42 potential targets for treating hypoovarianism， and the Gene Ontology enrichment mainly involved biological process （1 168 items）， cell composition（45 items）， and molecular function（59 items）. KEGG pathway enrichment showed that the pathways involved were AGE-RAGE， Prolactin and TNF signaling pathways. Three target genes Parkin/PINK1， HIF1A and MAPK8 were enriched in the Mitophagy-animal process.Animal experiments showed that the number of follicles increased and the atretic follicles decreased in the Chinese medicine treatment group. Electron microscopy found that mitochondrial swelling and mitophagy decreased in the Chinese medicine group. XJCRTST may play a therapeutic role in treating hypoovarianism by regulating mitochondrial function and mitophagy-related pathways in ovarian granulosa cells.

Key words∶Xinjia Cistanche Tusi Decoction; ovarian hypoplasia; network pharmacology; LC-MS；mitochondria

卵泡发育障碍是导致40岁以下女性月经稀发量少、闭经等病症的“罪魁祸首”，严重影响女性身心健康。近年来，受环境污染、工作学习压力增加、食品安全问题等因素影响，临床上卵巢功能减退类病症发病率逐年增高［1-2］，这类病症是以卵巢内卵泡的数量、质量降低，卵泡发育和成熟障碍，同时伴随低雌激素及高促性腺激素为特征，出现以稀发量少、月经紊乱甚至闭经、生育力降低或不孕的一类病症，包括卵巢储备功能低下（decline in ovarian reserbe，DOR）、早发性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）和卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）等［3］。西医尚无有效恢复患者卵巢功能的方法，多采用雌-孕激素补充或替代疗法（hormone replacement therapy，HRT），以改善患者围绝经期症状和维持人工月经，但停药后病情常常反复。中医学认为卵巢功能减退多因肾精不足、肾气亏虚、兼肝郁血瘀，造成冲任虚衰、天癸早竭而发病，以补肾益精、养血活血为基本治法，在结合明代医家武之望《济阴纲目》苁蓉菟丝丸与卓雨农《中医妇科治疗学》加减苁蓉菟丝丸的基础上，吴克明教授创制新加苁蓉菟丝汤，临床用于治疗卵巢功能减退类病症效果显著［4-7］，但其具体分子生物学机制尚未完全阐明。

因此，本研究利用液相色谱-质谱联用仪（liquid chromatograph mass spectrometer，LC-MS）技术、网络药理学筛选出方剂中的所有有效成分及其治疗卵巢功能减退的相关靶点和通路，进行动物实验验证，以期为后续研究提供一定参考方向。

1材料与方法

1.1新加苁蓉菟丝汤中药复方LC-MS物质鉴定分析

1.1.1新加苁蓉菟丝汤中药复方

肉苁蓉15 g、菟丝子15 g、黄精10 g、淫羊藿15 g、覆盆子10 g、山茱萸10 g、当归10 g、熟地10 g、泽兰10 g、乌药10 g（10味药，共重115 g）。规格：每115 g生药加工成12 g免煎颗粒剂。

1.1.2实验试剂和仪器

质谱乙腈（Fisher）、甲酸（Sigma-Aldrich）、质谱仪（TripleTOF5600+）、色谱仪（Nexera UHPLC LC-30A）。

1.1NoNhK/aHuKg4W0IaP053yQ==.3实验方法

取样品2.5 g于EP管，加入10 mL热水，超声10 min， 12 000 r/min转速下离心10 min，取上清液0.45 μm膜过滤后进样检测，进样10 μL。

1.2网络药理学分析

1.2.1主要活性成分筛选与潜在靶点信息收集

使用TCMSP（http：//tcmspw.com/tcmsp.php），将新加苁蓉菟丝汤中各味中药分别输入，并将口服生物利用度、类药性分别设置为OB>30%，DL>0.18［8-10］。通过R包将靶点转换成gene symbol。将质谱所获取的化合物输入Pubchem、Drugbank、TCMSP、SwissTargetPrediction平台来预测药物靶点，去重后，共得到374个靶点。使用Cytoscape 3.7.1构建网络。在GeneCards（https：//www.genecards.org）及OMIM（http：//www.omim.org）中进行搜索卵巢功能减退类病症，合并两个库的数据后去重，得到潜在疾病靶点。

1.2.2PPI 网络及网络拓扑分析

为更进一步阐明新加苁蓉菟丝汤对卵巢功能减退类病症的治疗作用，先利用R包对成分与疾病靶点取交集，并绘制Venn图。在STRING中的构建蛋白质-蛋白质网络（PPI）中选择筛选得到的交集靶点，生物种类选定为“人类”，作用阈值选择“highest confidence”后得到PPI网络，保存文件，利用Cytoscape3.7.1的“NetworkAnalyzer”工具进行分析，制图。

1.2.3疾病-靶点-成分作用机制

将合并后的疾病-靶点-成分关系文件，导入Cytoscape3.7.1进行网络构建。

1.2.4富集功能分析

将交集靶点利用R包进行GO和KEGG分析，分别对GO中的细胞组成（CC），生物学过程（BP），分子功能（MF）进行富集分析并制图；对KEGG通路进行分析，选取P < 0.01下前20的信号通路，并绘制柱状图。预测新加苁蓉菟丝汤对卵巢功能减退类病症的作用机制。

1.3动物实验验证

1.3.1实验动物

选取7～8周龄、体重约200～220 g的成年雌性SD大鼠30只，所有大鼠实验前在SPF级实验室条件下适应性喂养一周。光暗循环时间为12 h/12 h，相对湿度为40%～60%，并配以标准饮食和水，室内温度设置（25±2）℃。实验动物购自四川成都达硕生物科技有限公司，SD大鼠使用许可证：SYXK（川）2019-189；SD大鼠生产许可证：SCXY（川）2020-030。清洁级饲养，由专人负责更换垫料、饲料等。实验方案经过陕西中医药大学动物实验伦理委员会审查，审查批件号为SUCMDL20220304040。

1.3.2药物、试剂与仪器

新加苁蓉菟丝汤中药复方详见前LC-MS物质鉴定分析、雷公藤甲素（TP，生产批号：DST200515-034，成都德思特生物技术有限公司）、戊酸雌二醇片（补佳乐，德国拜耳医药）、醋酸甲羟孕酮片（浙江仙琚制药股份有限公司）、倒置生物显微镜（DMI1德国徕卡）、透射电镜（JEM-1400PLUS）。

1.3.3造模、分组和给药

购入7～8周龄、体重约200～220 g的成年雌性SD大鼠50只，选取其中动情周期正常的30只作为本次实验动物，随机选取5只为空白对照组，其余25只进行灌胃造模。雷公藤甲素500 μg/（kg·d） 30 d进行造模，各组大鼠均于灌胃结束前第10 d开始，每日9：00，使用阴道灌洗法采集各组大鼠阴道脱落上皮细胞：移液枪吸取30 μL生理盐水，缓慢插入大鼠阴道内3～5 mm，吹打3～5次，见液体变浑浊，立即回抽；将每只大鼠的阴道回抽液制备2份阴道涂片，进行巴氏染色制片，光镜下观察，各组大鼠均出现动情周期紊乱或延长，确定造模成功。将造模成功后的25只大鼠按随机数字表法分为5组，每组5只，分别为：模型组、西药组、中药高剂量组、中药中剂量组、中药低剂量组，随机预留的5只为空白对照组，总共6组。给药：每剂新加苁蓉菟丝汤生药总量为115 g，由陕西中医药大学药剂科制作成免煎颗粒剂（规格：每115 g生药加工成12 g免煎颗粒剂），按60 kg成人临床用药剂量为12 g/d为标准，根据《药理实验方法学》［11］等效剂量系数折算法，剂量大鼠=6.3×剂量（g/kg） （成人体重按60 kg计，大鼠按0.2 kg计）折合后计算出大鼠的用药剂量为高剂量2.52 g/（kg·d）、中剂量1.26 g/（kg·d）、低剂量0.63 g/（kg·d），按每只大鼠每100 g体重1 mL量灌胃，每日1次，连续2周。

1.3.4标本采集与指标检测

动物处死后，迅速解剖并分离双侧卵巢，固定组织，中性甲醛固定大于24 h冲洗后全自动脱水，石蜡包埋，冷却后切片，温水展片，60 ℃以上烤片10～30 min，自动HE染色仪加液染色，二甲苯脱蜡置水，中性树胶封片。光镜下观察卵巢结构变化及各级卵泡。新鲜卵巢组织3%戊二醛固定，1%四氧化锇再固定，丙酮逐级脱水，浓度间隔20%至5%逐渐缩小，环氧树脂置换80 ℃过夜包埋，包埋块显微镜下仔细修出便于切片的规整形态，分别以醋酸铀与枸橼酸铅染色风干后，JEM-1400PLUS透射电镜下观察卵巢颗粒细胞线粒体形态、线粒体自噬体。

2结果

2.1新加苁蓉菟丝汤中药复方分析及LC-MS物质鉴定分析

新加苁蓉菟丝汤临床用治卵巢功能减退类病症的基础方。本方主治DOR、POI、POF导致的月经后期量少、不孕症、复发性自然流产等多种妇科疑难病症。该方中肉苁蓉、菟丝子、黄精为君药，平补肝脾肾三脏，固肾益精。熟地、山茱萸、覆盆子、淫羊藿、当归五味药共为臣药，其中熟地滋肾阴、养精血，滋养肝肾之阴血，山茱萸养阴涩精，与熟地共用，补敛兼具，覆盆子和淫羊藿补益肝肾之精，又可同补肾中之阳，当归补血，为血中气药。泽兰为佐药，行气活血，调经祛瘀。乌药为使药，理气行滞。

通过混合四极TOF LC-MS质谱仪系统完成了对新加苁蓉菟丝汤成分鉴定。共鉴定出252个化合物，其中负离子物质168种、正离子物质84种，涵盖了蛋白质与氨基酸类、脂类、糖及其衍生物、有机酸、酚类和鞣质、醌类、内酯、香豆精和异香豆精类、木脂素类、萜类、挥发性成分、生物碱类等物质类别，其中以黄酮类、有机酸类、生物碱类含量较为丰富。（图1）

2.2基于网络药理学分析新加苁蓉菟丝汤治疗卵巢功能减退类病症的作用机制

2.2.1主要活性成分筛选与潜在靶点信息收集

新加苁蓉菟丝汤经质谱分析共得到252个化合物，其中负离子物质168种、正离子物质84种，将所获取的化合物输入Pubchem、Drugbank、TCMSP、SwissTargetPrediction平台来预测药物靶点，共得到374个靶点。在Gene Cards，OMIM、TTD、Drugbank数据库中输入Premature ovarian failure（POF）、Primary Ovarian Insufficiency（POI）、Diminished ovarian reserve（DOR）关键词进行搜索，将所得到的疾病基因合并去重后得到698个基因，再将数据导入R4.1.1中绘制韦恩图，见图2。得到新加苁蓉菟丝汤与“DOR/POI/POF”共有基因42个，即新加苁蓉菟丝汤治疗“DOR/POI/POF”潜在作用靶点有42个。

使用Pubchem、Drugbank、化源网对新加苁蓉菟丝汤中所获取的药物成分进行CAS号、相对分子质量、分子式进行补充，并结合质谱结果进行Precursor m/z与Reference m/z的补充，部分成分信息数据见OSID科学数据与内容附表1。

2.2.2PPI 网络及网络拓扑分析

将所得到的疾病基因与药物靶点取交集后输入STRING数据分析平台，进行蛋白互作用分析后，下载TSV文件导入Cytoscape3.7.1软件绘制PPI网络图，使用软件工具栏中的“Network Analyzer”功能，使度值越低的点、线越小越暗，度值越高的点、线越大越明亮，见图3和表1。网络图中共包含40个节点，203条边，图中圆形节点代表每个基因蛋白，边代表蛋白相互作用关系。使用“cytoHubba”对整个网络进行度值分析，得到蛋白互作关系排名前10的蛋白为COMT、HIF1A、AKT1、CHRNA4、VEGFA、MAOA、TNF、ESR2、ESR1、SLC6A3。

将筛选得到的基因输入Cytoscape3.7.1中，选择BisoGenet功能，绘制出蛋白互作网络PPI，共得到2 200个节点，45 832条边。使用CytoNCA插件对整体网络进行网络拓扑分析，选择DC模式，并选择最小值61筛选得到网络图，筛选后共得到466个节点，16 623条边。将所得到的网络图放大后选择BC模式，最小值选择600筛选得到网络图，筛选后共得到72个节点，1 058条边，见OSID科学数据与内容附图1。

2.2.3疾病-靶点-成分作用机制

将所得到的药物成分CAS号和疾病基因靶点导入Cytoscape3.7.1绘制“疾病-靶点-成分”网络图，得到包括147个节点和153条边，每条边则表示化合物分子与靶点之间的潜在作用关系，见图4。

2.2.4富集功能分析

通过R4.1.1对潜在治疗靶点进行GO功能富集和KEGG通路富集可视化。在GO功能富集过程中共得到1 272条结果，主要涉及BP（1 168项）、CC（45项）和MF（59项）。以pvalueCutoff=0.05， qvalueCutoff=0.05为筛选条件，获得1 272个条目，筛选出涉及BP、CC和MF的前20条富集结果。在BP方面，主要涉及对活性氧代谢过程调控、对单胺转运的调控、对磷脂酶C激活G蛋白偶联受体信号通路的调控、对多巴胺代谢过程的调控等，见图5（a）；在CC方面，主要涉及突触后膜、突触膜、线粒体、膜蛋白突触后膜的固有成分、膜筏等，见图5（c）；在MF方面，主要涉及儿茶酚胺结合、胺结合、神经递质受体活性、G蛋白偶联胺受体活性、突触后神经递质受体活性、核受体活性、配体激活转录因子活性等，见图5（b）。KEGG通路富集显示新加苁蓉菟丝汤参与的通路有AGE-RAGE信号通路、Prolactin信号通路及TNF信号通路、HIF-1信号通路、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路等，Mitophagy-animal过程等，KEGG通路见图5（d）。Mitophagy-animal过程中共富集了三个靶基因Parkin/PINK1、HIF1A、MAPK8。其中PINK1作为线粒体去极化的传感器，招募Parkin，然后泛素依赖性招募线粒体吞噬受体。Mitophagy-animal过程，见图6。

2.3新加苁蓉菟丝汤动物实验验证结果

2.3.1中药对大鼠卵巢组织形态学的影响

光镜观察下，与空白对照组（Control）相比，TP模型组（TP）卵巢组织病理改变程度显著加重，可见卵泡数量减少，闭锁卵泡增多，颗粒层细胞排列紊乱、脱落、坏死、卵泡囊性扩张和血管充血等病理改变。与TP组相比较，新加苁蓉菟丝汤低剂量组（TP+XJCRTST-Low）卵巢组织病理改变程度相对略微减轻，新加苁蓉菟丝汤中剂量组（TP+XJCRTST-Middle）组卵巢组织病理改变程度相对较轻，TP+XJCRTST-High组和西药组（TP+EV）卵巢组织病理改变程度相对最轻。（详见图7）

2.3.2中药对大鼠卵巢颗粒细胞中线粒体形态学的影响

Control组：电镜下见卵巢颗粒细胞其细胞核呈不规则多边形，染色质分布均匀，以常染色质为主，核膜清晰完整；胞浆中可见线粒体、粗面内质网和核糖体等细胞器且结构完整清晰。TP组：卵巢颗粒细胞中见大量肿胀的线粒体，其嵴断裂、溶解甚至消失，偶见有线粒体自噬。TP+EV组：卵巢颗粒细胞中多数线粒体已发生轻度肿胀，亦可见多量线粒体自噬。TP+XJCRTST-High组：卵巢颗粒细胞中多数线粒体已发生轻度肿胀，亦可见多量线粒体自噬。TP+XJCRTST-Middle组：卵巢颗粒细胞中多数线粒体已发生轻度肿胀，可见有少量线粒体自噬。TP+XJCRTST-Low组：卵巢颗粒细胞中多数线粒体已发生肿胀，嵴断裂、溶解甚至消失，偶见有线粒体自噬。（见图8）

3讨论

卵巢功能减退是指卵巢内可募集卵泡数量和质量降低，并伴随低雌激素及高促性腺激素，临床表现为月经紊乱或闭经，生育力降低或不孕。根据中医学肾藏精、主生殖和精血同源的基本理论，认为卵子属肾中之精，精能生血，血可养精，卵泡发育赖于肾精充盛，卵子排出有赖肾气鼓动，因此，卵巢功能减退的核心病机是肾气不足、精血亏虚，因虚致瘀，根本治法应补肾益精、养血活血。课题组临床运用补肾养血活血中药复方新加苁蓉菟丝汤，治疗卵巢功能减退类疾病疗效肯定［4-7］。

本研究通过LC-MS技术和网络药理学，共筛选出补肾养血活血中药复方新加苁蓉菟丝汤中的有效成分252种，以黄酮类、有机酸类、生物碱类含量较为丰富；其治疗卵巢功能减退类疾病潜在作用靶点有42个、得到COMT、HIF1A等蛋白是其核心靶点，参与通路主要涉及AGE-RAGE、Prolactin及TNF信号通路等，Mitophagy-animal过程中共富集了3个靶基因Parkin/PINK1、HIF1A、MAPK8。本次筛选出新加苁蓉菟丝汤中有效成分黄酮类物质，也是本方君药肉苁蓉和菟丝子的主要活性成分，在以往研究中显示［12-14］：菟丝子黄酮可减轻因雷公藤多苷造成的大鼠POF，促进颗粒细胞增殖，其在大鼠体内具有雌激素样活性，通过影响动物下丘脑-垂体-性腺轴发挥对生殖内分泌系统的作用；肉苁蓉总黄酮抗氧化效果最佳，能提高线粒体抗氧化活性，改善线粒体功能。后续筛选出的富集靶基因Parkin/PINK1，是目前研究较多的、经典的线粒体质量控制信号通路， PINK1是具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性的线粒体外膜蛋白， 作为分子感受器，接收受损线粒体的分子信号; Parkin是具有E3泛素连接酶活性的蛋白， 主要有调节蛋白降解和信号转导等作用。PINK1位于Parkin上游， 两者间协调控制各自表达水平， 诱导线粒体自噬发生［15］。以上研究结果提示新加苁蓉菟丝汤中黄酮类药效成分可能是通过线粒体质量控制信号通路发挥其治疗作用。

进一步的动物实验表明：模型组大鼠卵泡数量减少，闭锁卵泡增多，颗粒层细胞脱落等病理改变，而中药各组卵巢卵泡数量增加、颗粒细胞脱落等病理改变减轻。电镜观察表明，与模型组相比，经中药各组治疗后，颗粒细胞线粒体肿胀减轻，其嵴断裂、溶解、消失均未明显见到，同时线粒体自噬现象增多，表明新加苁蓉菟丝汤可能通过改善线粒体病理状态、修复线粒体功能的同时，增加线粒体自噬水平从而起到修复颗粒细胞损伤的作用。以上研究结果初步表明新加苁蓉菟丝汤可能通过线粒体自噬途径促卵泡发育的分子机制。

本研究基于LC-MS、网络药理学及动物实验后期验证，初步证实新加苁蓉菟丝汤通过线粒体自噬途径促卵泡发育的分子机制，这一结果为后期深入探讨该方在治疗卵巢功能减退类病症的分子机制奠定了基础，为补肾养血活血类中药复方通过颗粒细胞线粒体自噬促卵泡发育的研究提供了新方向。但本实验也存在不足之处，如未将线粒体自噬通路相关蛋白做Western blot检测。

参考文献：

［1］DEVINE K， MUMFORD S L， WU M E， et al. Diminished ovarian reserve in the United States assisted reproductive technology population： Diagnostic trends among 181， 536 cycles from the Society for Assisted Reproductive Technology Clinic Outcomes Reporting System［J］. Fertility and Sterility， 2015， 104（3）： 612-619.e3. DOI： 10.1016/j.fertnstert.2015.05.017.

［2］ATA B， SEYHAN A， SELI E. Diminished ovarian reserve versus ovarian aging： Overlaps and differences［J］. Current Opinion in Obstetrics & Gynecology， 2019， 31（3）： 139-147. DOI： 10.1097/GCO.0000000000000536.

［3］贺宇. 补肾养血活血法治疗卵泡发育障碍类疾病的导师临床经验总结及实验研究［D］. 成都： 成都中医药大学， 2020.

［4］刘小红， 霍君怡， 罗前， 等. 吴克明教授运用新加苁蓉菟丝子丸治疗卵巢早衰助孕成功经验撷粹［J］. 云南中医中药杂志， 2016， 37（4）： 19-22. DOI： 10.16254/j.cnki.53-1120/r.2016.04.009.

［5］黄莎， 苏靖， 吴克明. 吴克明教授运用新加苁蓉菟丝子丸治疗不孕症验案举隅［J］. 中医临床研究， 2015， 7（1）： 83-84. DOI： 10.3969/j.issn.1674-7860.2015.01.045.

［6］郭志清， 黎洁， 苏靖， 等. 吴克明运用苁蓉菟丝子丸调治月经后期经验［J］. 湖南中医杂志， 2014， 30（11）： 45-46. DOI： 10.16808/j.cnki.issn1003-7705.2014.11.019.

［7］蔡光霞， 田维萍， 何雨聪， 等. 吴克明教授治疗卵巢储备功能下降经验撷箐［J］. 世界中西医结合杂志， 2013， 8（7）： 664-665. DOI： 10.13935/j.cnki.sjzx.2013.07.008.

［8］宋予馨，雷萍，魏东升， 等.基于网络药理学及生物信息学探讨归脾汤改善化疗肌无力的作用机制［EB/OL］.［2024-03-20］. http：//kns.cnki.net/kcms/detail/21.fQuGXHNgQ+LtwIGJBNYy4CorkSH17gotL89u7+pddvA=1187.R.20240308.1030.004.html.

［9］代婷媛，王剑波，徐福平，等.基于网络药理学的舒心安神汤抗抑郁实验研究［J］.中药药理与临床，2024，40（5）：14-22.DOI：10.13412/j.cnki.zyyl.20240307.003.

［10］卯银辉，王卓，孙军涛，等.逍遥散治疗糖尿病性勃起功能障碍的网络药理学分析及实验［EB/OL］.［2024-03-20］. https：//doi.org/10.13422/j.cnki.syfjx.20240414.

［11］徐叔云. 药理实验方法学［M］. 3版. 北京： 人民卫生出版社， 2002.

［12］黄长盛， 贺守第， 管雁丞， 等. 菟丝子黄酮和槲皮素对雷公藤多苷致卵巢早衰大鼠卵巢功能的影响［J］. 中国临床药理学杂志， 2020， 36（6）： 667-670. DOI： 10.13699/j.cnki.1001-6821.2020.06.021.

［13］刘倩， 田元春， 宾彬， 等. 菟丝子黄酮对生殖系统的保护作用研究进展［J］. 中医药导报， 2020， 26（12）： 148-151. DOI： 10.13862/j.cnki.cn43-1446/r.2020.12.037.

［14］邓楠， 申雅娟， 丁辉， 等. 肉苁蓉多糖类成分药理作用研究进展［J］. 辽宁中医药大学学报， 2020， 22（6）： 67-71. DOI： 10.13194/j.issn.1673-842x.2020.06.018.

［15］SATO S， FURUYA N. Induction of PINK1/parkin-mediated mitophagy［M］//Mitophagy. New York， NY： Springer New York， 2017： 9-17. DOI： 10.1007/7651_2017_7.