毛头鬼伞漆酶基因Cc_lac21的克隆及生物信息学和组织表达分析

摘要：为了确定毛头鬼伞基因组中漆酶基因Cc_lac21的“缺口”序列及可能的生理功能，本研究对其进行克隆和生物信息学分析，并以18S rDNA为内参基因，检测菌丝阶段以及商品成熟阶段子实体的菌盖、菌柄顶端和菌柄基部Cc_lac21的表达水平。结果表明，Cc_lac21基因全长2 243 bp，含有12个内含子、13个外显子，编码序列为1 452 bp，编码483个氨基酸。Cc_Lac21为稳定的亲水性蛋白，N端前17个氨基酸为信号肽序列，分泌到胞外；二级结构以无规则卷曲和延伸链为主；在28个丝氨酸（S）、21个苏氨酸（T）和5个酪氨酸（Y）上可能发生磷酸化修饰；在第286位的苏氨酸和第381位的丝氨酸处可能发生o-糖基化修饰；含有3个铜氧化蛋白结构域，分别是2个铜氧化还原蛋白超家族（cupredoxin super family）和1个云芝Tv-LCC样真菌漆酶的第三个铜氧化还原域（CuR0_3_Tv-LCC9）；与鳞白环蘑漆酶的亲缘关系最近，包含3个基序。通过RT-qPCR分析发现，Cc_lac21在菌丝体阶段和成熟菌柄基部表达量高，在菌盖和伸长生长的菌柄顶端表达量低，推测Cc_lac21可能参与基质木质素的降解以及菌柄中菌丝细胞壁的成熟过程。本研究结果可为探究漆酶基因参与菌柄细胞壁成熟机制奠定基础。

关键词：毛头鬼伞；漆酶基因Cc_lac21；生物信息学分析；表达分析

中图分类号：Q781：S567.3 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2024）09-0013-09

毛头鬼伞（Coprinus comatus）又称“鸡腿菇”，属于担子菌门鬼伞科鬼伞属真菌，是一种优良食药兼用菌，对农作物秸秆有较强的降解能力，能够分泌包括漆酶（laccase，E.C.1.10.3.2）在内的木质纤维素水解酶。漆酶属于多铜蛋白家族，因最早从日本漆树（Rhus verniajluo）分离到而得名，广泛存在于细菌、真菌、植物和昆虫等各种生物体中，具有氧化多种芳香族和非芳香族化合物的能力，包括取代酚类化合物、一些无机离子和多种非酚类化合物，能对酚类物质进行单电子氧化，并利用氧作为最终的电子受体，生成副产物水。相比于细菌漆酶，真菌漆酶具有更高的氧化还原电势，生物学功能多样，因而备受青睐。如：真菌漆酶可以降解酚类、非酚类木质素相关化合物为高度耐降解的物质，有利于酚类物质清除：还可以对工业纺织废水进行脱色和解毒，从而有助于废水的生物修复。Clark等以昆虫为反应器对真菌漆酶进行表达，实现了对工业污染物的原位生物修复。球孢白僵菌（Beauceria bassiana）漆酶BbLac2参与卵孢菌素合成，在逃避昆虫免疫反应中扮演了多功能角色。柑橘漆酶CsLAC6可能与褐斑病的发生有关，其表达量上调对柑橘果皮褐斑的形成起促进作用。一色齿毛菌（Cerrena unicolor）漆酶Lac5具有较好的耐热性且对黄曲霉毒素B1（AFB1）有良好的降解效果。此外，漆酶还参与真菌的生物合成、木质素降解、子实体形态发生等过程。

随着越来越多菌物基因组被解析，大量的食药用真菌的漆酶基因被研究报道，如皱木耳（Auricularia delicata）、荷叶离褶伞（Lyophyllum decastes）、平菇（Pleutoms ostreatus）、杏鲍菇（Pteurotus eryngii）和松杉灵芝（Ganoderma tsugae）、杨树菇（Agrocybe aegerita）、草菇（Volvariella volvacea）、云芝（Trametes versicolor）等。在毛头鬼伞中，Bao等克隆了毛头鬼伞漆酶基因lac1和lac2并在毕赤酵母中进行了异源表达，它们分别编码517个和523个氨基酸：之后Gu等克隆了毛头鬼伞的另外2个漆酶基因lac3和lac4，它们分别编码547个和532个氨基酸。

但当前美国生物技术信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）数据库中毛头鬼伞的基因组数据ASM331602vl（登录号：GCA_003316025.1）还是一个“草图”结果，不仅缺少注释信息，而且含有很多缺口，Contig N50值仅为17 206 bp，组装质量较差。前期基于此毛头鬼伞基因组数据，我们预测到至少21个漆酶基因，包括Cc_lac21，但基因序列中有大量不确定的碱基信息，未能确定其氨基酸序列。基于此，本研究中我们设计特异性引物克隆Cc_lac21的全长序列，并填补“缺口”序列，然后对其开展生物信息学分析，并检测其在毛头鬼伞不同发育阶段子实体不同部位中的表达情况，以期为阐明Cc_lac21在毛头鬼伞生长发育过程中的生理功能以及开发利用毛头鬼伞漆酶等奠定基础。

1材料与方法

1.1菌株和引物

毛头鬼伞QLKL-01菌株通过标本QLS20170822002（采自祁连山国家级自然保护区康乐自然保护站，东经99.876709°，北纬38.905996°）组织分离获得，现保藏于河西学院祁连山菌物活体组织库。所有引物均由生工生物工程（上海）有限公司（简称生工生物公司）合成，其中，基因克隆引物（lac2/F：5’-ATGCTGTCCTCT-GCCCTCCT-3’：lac21R：5’-CTAGAA，ITCTGGAAGATAGTCAATATAGCTAG-3’）基于之前lac21的生物信息预测序列使用Vazyme公司的CE Design软件设计，RT-qPCR分析所需漆酶基因lac21引物（lac2/qF：5’-GACACAAGITITCCCACGCC-3’：/ac2/qR：5’- CAGTGGTCTCGCTGTTGTCT -3’）和内参基因18S rDNA引物（18S rDNAF：5’- AAACGGCTACCACATCCA-3’；18SrDNAR：5’-CAC-CAGACITGCCCTCCA-3’）均采用NCBI PrimerBlast在线设计。