粉葛PtERF98基因克隆及表达分析

摘要：乙烯响应因子（e山ylene responsive facLor，ERF）是植物特有的一类转录因子，在乙烯信号转导通路、植物生长发育和逆境胁迫响应中起重要的调控作用。为探明PLERF98转录因子在粉葛（Pueraria thomsonii Benth.）块根采后生理性变质（posL-harvesL physiological deIerioration，PPD）过程中的表达调控机制，本研究采用RT-PCR技术从火山粉葛叶组织中克隆PtERF98基因，并对其进行生物信息学、组织表达特异性分析和在PPD过程中的表达分析。结果显示，PtERF98基因CDS序列长450 bp，编码149个氨基酸残基，PIERF98蛋白理论分子量为16.93 kDa，理论等电点为8 06，为亲水性不稳定蛋白。蛋白结构分析显示，PtERF98具有典型的AP2保守结构域，属于ERF转录因子家族成员，定位于细胞核，无跨膜螺旋结构，含有1个信号肽和16个磷酸化位点。氨基酸序列同源性和系统进化关系分析表明，PtERF98与大豆（Clycine max）CmERF98同源性最高且亲缘关系最近。组织表达分析显示，PtERF98基因在火山粉葛的根、茎、叶中均有表达，且在不同组织中的相对表达量存在差异，叶中表达量最高。此外，PtERF98的表达受到PPD的显著诱导，表达水平随着PPD时间延长呈先升高后下降趋势，并在采后48 h达到最高，推测该基因可能参与粉葛块根的PPD过程。本研究可为深入了解PtERF98基因的功能及其在粉葛PPD过程中的表达调控作用奠定研究基础。

关键词：粉葛；乙烯信号通路；PIERF98转录因子；采后生理性变质；生物信息学分析；表达分析

中图分类号：Q781：S567.9 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2024）09-0006-07

粉葛（Pueraria thomsonii Benth.）是豆科蝶形花亚科葛属藤本植物，在我国广泛分布。它的茎基部木质化，并带有肥厚的块状根。研究发现，粉葛含有多种活性成分，主要包括葛根素、大豆苷元、染料木素、异甘草素等异黄酮类化合物，以及皂角精醇、槐二醇、大豆苷醇等皂苷类物质。火山粉葛是中国国家地理标志产品之一，因生长在广东省韶关市曲江区大塘镇火山地区而得名。与其他产地的粉葛相比，火山粉葛具有肉质根，口感绵软细嫩，味道甘甜，淀粉含量高，水分和纤维含量低，素有食不留渣的优越品质。作为一种“药食同源”作物，火山粉葛具有保护心脑血管系统、降血糖和血脂、抗肿瘤、抗氧化、解酒等生物活性。此外，火山粉葛富含优质蛋白质、多糖及多种微量元素，不仅可以作为美食，还有清热、养肝、理气、养颜等医用功效，具有极高的食用价值和保健价值。同时植株还具有耐寒、抗旱和耐贫瘠等特性，是一种具有巨大发展潜力的绿色能源植物。然而，粉葛的块根在采收后2-3 d便会发生腐烂霉变等采后生理性变质（post-harvest physiological deterioration，PPD）现象，严重制约它的贮藏、加工、运输和利用。因此，研究粉葛PPD的分子机制对于粉葛产业的可持续发展具有重要意义。

乙烯（2-chloroethylphosphonic acid）是植物重要的内源激素，对植物的生长发育和非生物胁迫响应起重要作用。例如，在植物缺水时，乙烯水平迅速升高，以促进植物叶片老化和脱落，维持植物体内水分平衡。乙烯前体处理能显著提高拟南芥（Arabidopsis thaliana）幼苗在高盐胁迫下的存活能力。此外，乙烯信号与活性氧含量变化的相关性也得到研究证实。在皇冠梨（Pyrus bretschneideri）中，乙烯通过提高过氧化氢酶和超氧化物歧化酶的活性来抑制采后腐烂。拟南芥中的乙烯信号转导通路的关键成员包括乙烯受体（ethylene receptors）、CTR1蛋白激酶（Raf-like CTRl）、EIN2（ ethylene insensitive 2）、EIN3（ethylene insensitive 3）/EILl（ethylene insensitive like l）、ERFl（ ethylene response factor l）以及EBFl/2（EIN3 binding F-box l and 2）等。作为乙烯信号途径中的核定位转录因子，ERF（ethylene responsive factor）转录因子属于具有典型ERF结构域的AP2/ERF转录因子大家族。ERF98是ERF家族的重要成员，在多种非生物胁迫应激反应中发挥调控功能。例如，拟南芥AtERF98通过调控维生素C合成关键基因的表达，增强维生素C的合成能力，以清除盐胁迫下积累的活性氧，提高盐胁迫的耐受性。桃树（Prunus persica）的PpERF98与PpERFl相互作用，共同介导茉莉酸／乙烯信号途径中的ERF分支，从而负调控桃树对流胶病菌（Lasiodiplodia theobromae）的抗性。然而，目前有关粉葛ERF转录因子的研究鲜有报道。

以往的研究显示，活性氧积累是块根类作物发生PPD的根本原因之一，而酶促褐变是PPD过程中最为明显的表现，其诱因是细胞组织中原有的酚类物质被氧化成醌类化合物进而聚集形成褐色或黑色物质。课题组前期研究显示，乙烯处理能够通过提高抗氧化系统相关基因的表达来提升抗氧化酶的活性，继而显著抑制火山粉葛PPD进程，但响应机制尚不明确。因此，本研究基于前期火山粉葛转录组数据分析，从火山粉葛叶组织中克隆PtERF98基因编码区（CDS）序列，并对其进行生物信息学和组织表达特异性分析，以明确该基因在PPD不同阶段的表达模式，为深入研究PtERF98基因功能及其在粉葛PPD过程中的分子调控机制提供基础，也为通过现代育种技术培育火山粉葛优良品种提供基因资源。