对神经元氧化应激损伤具有保护活性的灵芝化合物体外筛选及作用机理

摘要：【目的】筛选灵芝中具有保护神经元活性的化合物，并探究其相应的作用机理，为研发具有预防和治疗阿尔茨海默病（AD）功效的灵芝功能性食品、保健品和药品提供科学依据。【方法】基于β-淀粉样蛋白（Aβ）诱导的氧化损伤建立细胞模型，对1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除法、铁离子还原/抗氧化能力检测法和2，2-联氮-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（ABTS）自由基清除法初步评估得到的抗氧化活性较强的灵芝醇提物进行筛选，并对其神经元保护活性进行评价。进一步利用灵芝醇提物中与抗氧化有关的4种三萜类化合物，验证其活性并通过表面等离子共振技术探究其相关作用机理。【结果】DPPH、ABTS自由基清除及铁离子还原/抗氧化能力等体外理化初筛与细胞水平筛选试验结果表明，6种灵芝醇提物（108、161、106-2、171、173和109）抗氧化保护神经元活性较强，其中108、109和106-2样品对大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤细胞（PC12细胞）氧化应激损伤的保护效果最好；灵芝醇提物可通过缓解细胞周期紊乱、抑制细胞早期凋亡、提高超氧化物歧化酶（SOD）活性和谷胱甘肽（GSH）含量，抑制丙二醛（MDA）含量上升来发挥神经元保护作用。灵芝醇提物108、106-2和109中4种三萜类化合物（灵芝醛A、灵芝酸B、灵芝酸C2和灵芝酸LM2）的平均含量占比相对较高。活性验证表明4种化合物对细胞氧化应激损伤均有明显修复效果，其中灵芝醛A与Aβ1 42具有较强的亲和力，其KD值为15.62μmol/L，可通过与Aβ1 42竞争性结合来抑制Aβ1 42与RAGE结合。【结论】灵芝醇提物的抗氧化神经元活性通过灵芝酸C2、灵芝酸B、灵芝酸LM2和灵芝醛A 4种化合物的协同效应来实现。灵芝醛A能通过与RAGE竞争性结合来减轻或抑制Aβ1 42细胞毒性作用。灵芝具有开发防治AD功能性产品的潜力。

关键词：灵芝醇提物；淀粉样β蛋白肽；灵芝三萜；自由基；阿尔茨海默病

中图分类号：S567.310.99文献标志码：A文章编号：2095-1191（2024）07-1935-14

In vitro screening and mechanism study of Ganodermalucidumcompounds with protective activity against neuronaloxidative stress injury

MAYing-chun ZHANG Jing-song JIA Wei YU Zi-hang 3，YANG Yan 3，LIU Yan-fang ZHANG He-nan TANG Chuan-hong ZHANG Ya-ping WANG Wen-han

（1College of Life Sciences，Shihezi University，Shihezi，Xinjiang 832003，China；2Institute of Edible Fungi，Shanghai Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Edible Fungal Resources and Utilization（South），Ministry of Agriculture and Rural Affairs/National Engineering Research Center of Edible Fungi/Key Laboratory of AgriculturalGenetics and Breeding of Shanghai，Shanghai 201403，China；3College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China）

Abstract：【Objective】Screening for compounds in Ganoderma lucidum that had neuroprotective activity and explo-ring their corresponding mechanisms of action，to provide scientific basis for the research and development of functional foods，health products and drugs with the effects of preventing and treating Alzheimer disease（AD）.【Method】This study established a cellular model based onβ-amyloid protein（Aβ）induced oxidative damage，and screened the antioxi-dant activity of G.lucidum alcohol extracts preliminarily assessed by the 1，1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine（DPPH）free radical scavenging method，iron ion reduction/antioxidant capacity test，and 2，2-azinobis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）ammonium salt（ABTS）free radical scavenging method，and evaluated their neuronal protective activity.Furthermore，the 4 triterpenoids compounds related to antioxidants in G.lucidum alcohol extracts were used to verify their activity and to explore their related mechanisms through surface plasma resonance technology.【Result】The results of in vitro physicochemical primary screening and cellular level screening experiments on DPPH and ABTS free radical scavenging，iron ion reduction/antioxidant capacity indicated that 6 G.lucidum alcohol extracts（108，16 106- 17 173 and 109）had strong antioxidant protective activity for neurons，among which samples 108，109 and 106-2 showed the best protective effects against oxidative stress damage in rat adrenal pheochromocytoma（PC12）cells.The G.lu-cidum alcohol extracts could exert neuroprotective effects by alleviating cell cycle disruption，inhibiting early cell apopto-sis，enhancing superoxide dismutase（SOD）activity and glutathione（GSH）content，and suppressing the increase of malondialdehyde（MDA）content.The average contents of 4 triterpenoids（ganoderal A，ganoderic acid B，ganoderic acid C and ganoderic acid LM2）in G.lucidum alcohol extracts numbered 108，106-2 and 109 were relatively high.Ac-tivity validation demonstrated that these 4 compounds all exhibited obvious reparative effects against cellular oxidative stress damage.Among them，ganoderalA and Aβ1-42 showed strong affinity，with a KD value of 15.62μmol/L，and could inhibit the binding of Aβ1-42 to RAGE through competitive binding with Aβ1-42.【Conclusion】The antioxidant neuronal ac-tivity of G.lucidum ethanol extracts is achieved through the synergistic effects of 4 compounds：ganoderic acid C ganoderic acid B，ganoderic acid LM2 and ganoderalA.GanoderalA can alleviate or inhibit the cytotoxic effects of Aβ1-42 by competitively binding with RAGE.G.lucidum has the potential for developing into a functional product for the preven-tion and treatment of AD.

Key words：Ganoderma lucidum ethanol extract；amyloidβ-protein peptide；Ganoderma lucidum triterpenes；free radical；Alzheimer disease

Foundation items：Shanghai Modern Agricultural Industry Technology System（HNKCZ〔2023〕9）；Excellence Team Construction Plan Project of Shanghai Academy of Agricultural Sciences（Hunongkezhuo〔2022〕003）

0引言

【研究意义】在氧化应激状态下，过量活性氧（ROS）会破坏细胞蛋白、脂质和DNA，导致细胞致命损伤，进而涉及多种病理现象出现，例如衰老、癌症、神经退行性疾病、心血管疾病和糖尿病等（Hajam et al.，2022）。阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病，其特征为痴呆、记忆丧失和认知障碍。社会老龄化导致AD发病率不断上升，AD影响全球约5000万人，预计到2050年增至1.52亿人，中国约有1000万人患有AD，到2050年将超4000万人（Nichols et al.，2019）。突触功能障碍是AD的一个关键早期病理特征，与认知障碍的出现和发展相关（DeKosky and Scheff，1990；Terry et al.，1991；Masliahetal.，1994）。有研究发现，额叶皮层的突触损伤是AD的早期事件（Masliahetal.，2001）；AD早期阶段已发生突触丧失和轻度认知障碍（Scheffetal.，2007）。这些研究均表明脑内大量神经元突触丢失在AD初期阶段已发生，提示在初期阶段β-淀粉样蛋白（β-amyloid pro-tein，Aβ）已与某些通道蛋白的某个位点结合，而结合位点相应细胞内的信号通路也随之被激活，最终通过氧化应激神经元细胞毒级联反应诱发神经功能障碍（Yan et al.，2007）。Aβ可通过诱导ROS表达升高，不仅使得在神经细胞膜系统中的质膜所含双键受到ROS攻击、同时蛋白结构发生变化，导致其活性丧失，进而影响下游功能变化，还使得DNA复制时的准确度受影响，导致DNA分子也被损害（Wang et al.，2009；Hiramatsu et al.，2010；Huang et al.，2012）。Aβ诱导的氧化应激使ROS过量产生，压制内源性抗氧化酶系统，破坏细胞氧化还原平衡，导致细胞凋亡和死亡发生，因此，抑制Aβ诱导的氧化应激可为神经元提供保护。【前人研究进展】已有不少学者对灵芝提取物的活性及作用进行相关研究。Mau等（2005）研究表明，灵芝三萜和多糖具有较强的抗氧化活性，可清除羟基自由基和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基。Ajith等（2009）发现灵芝提取物可显著提高线粒体中丙酮酸脱氢酶、α-酮戊二酸琥珀酸脱氢酶复合物I和II的活性，降低脂质过氧化水平。Hasnat等（2013）在体内试验中发现灵芝可通过抗氧化活性发挥神经元保护作用，利用发芽糙米培育的灵芝可显著提高小鼠血清、肝脏和大脑中抗氧化酶活性。Lin等（2015）采用超临界二氧化碳分离灵芝提取物，发现其抗氧化能力与总三萜、总多酚呈正相关。Wang等（2019）在体外测试灵芝子实体中分离的化合物对已进行H2O2和老化Aβ诱导SH-SY5Y细胞的抗氧化能力与神经保护活性，结果表明灵芝及其代谢产物（尤其是亚萜类化合物）可能是抗氧化和预防神经源性疾病的潜在功能性食品成分。Kolniak-Ostek等（2022）对灵芝子实体的抗癌和抗氧化活性及生物活性化合物进行评估，结果表明灵芝提取物中富含酚类化合物和三萜类化合物等生物活性成分，灵芝提取物在抗氧化应激相关疾病如癌症的治疗中可能具有一定作用。为了确定从灵芝中提取的三萜类化合物的抗氧化活性，Dong等（2019）使用分离出的部分三萜类化合物清除DPPH自由基和2，2-联氮-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（ABTS）自由基，其中灵芝E和灵芝F通过ABTS方法表现出抗氧化活性。Zheng等（2020）使用乙醇浸提法提取灵芝三萜类化合物，并利用DPPH方法评估其抗氧化活性，发现该方法依赖于萜类化合物的浓度。灵芝对AD的预防作用涉及多种机制，包括通过抑制星形胶质细胞活性、降低促炎细胞因子水平、改善线粒体功能、提高抗氧化活性和调节Ca2+稳态来防止有害的Aβ过度积累（Sułkowska-Ziajaetal.，2023）。Ahmad等（2023）选取灵芝提取物中5种化合物，利用分子动力学模拟和分子力学广义Born表面积（MMGBSA）自由能计算等进行预测，发现灵芝酸A和灵芝酸B可能是2种有前途的灵芝化合物，可对抗微管蛋白亲和力调节激酶4（MARK4）。Li等（2024）分离出6个β-淀粉样蛋白42（Aβ42）原纤维分解剂，包括灵芝三醇、灵芝酸DM、灵芝三醇F、灵芝醇B、灵芝油酚和麦角甾醇；通过体外神经保护评估发现麦角甾醇和灵芝酸DM不仅能显著缓解Aβ42诱导体内认知功能障碍和海马神经元丢失，还可显著抑制Aβ42诱导的神经元凋亡和核因子E2相关因子2（Nrf2）介导的体外与体内神经元氧化应激。【本研究切入点】虽有研究表明灵芝具有保护神经元功效，但其发挥作用的活性化合物及相关作用机理尚不明确。大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤细胞（PC12细胞）是研究神经元细胞信号转导、神经元分化和神经退行性疾病的常用神经元细胞（Vaudryetal.，2002）。在模拟神经分泌过程中PC12细胞与其他常用的神经元细胞（SH-SY5Y和Neuro-2a细胞）相比，具有较大的量子尺寸和可释放囊泡数量多等优点，在胞吐作用和神经毒理学等研究方面有独特的应用价值（Westerink and Ewing，2008；Xie et al.，2023）。同时，PC12细胞模型可用于抗AD或抗衰老药物的开发（Li and Buccafusco，2003）。Aβ25 35可诱导PC12细胞的氧化应激、炎症反应和细胞凋亡，从而模拟AD的病理特征（Shi et al.，2021）。Aβ25 35是Aβ的一个片段，该片段由25～35个氨基酸残基组成，在体外显示出神经毒性作用，能激活tau蛋白激酶I/糖原合成酶激酶-3β（TPKI/GSK-3β），降低细胞存活率，且能增加兴奋性反应的幅度（Song et al.，2018）。Aβ25 35在AD病理学的研究中被广泛使用，尤其是在研究AD的治疗策略和药物筛选方面。因此，可用Aβ25 35建立神经元退行性疾病细胞模型，对灵芝醇提取物保护神经元免受氧化应激损伤的活性成分进行筛选，并探究其作用机理。【拟解决的关键问题】利用Aβ诱发神经元氧化应激损伤理论建立的细胞水平模型，对灵芝醇提物进行抗氧化活性筛选，并对筛选得到的与神经元保护活性密切相关的4种化合物进行药效物质基础验证和相关作用机理研究，明确灵芝中真正起抗氧化作用的活性成分及其如何发挥抗氧化功效，为研发具有预防和治疗AD功效的灵芝功能性食品、保健品和药品提供科学依据。

1材料与方法

1.1试验材料

上海市农业科学院食用菌研究所实验室前期制备了64种灵芝子实体醇提物，并测定每种醇提物的DPPH清除率（杨妍等，2020）；本研究从中选取18种DPPH清除率高于30%的灵芝子实体来制备醇提物。18种灵芝子实体的菌株样品号及其来源：12号（河南省西峡县食用菌科研中心）；17号（河南省农业科学院食用菌研究所）；22号（福建省农业科学院植物保护研究所）；47号（河北省微生物研究所）；54号（江苏省高邮市科学食用菌研究所）；94号（河南省西峡县食用菌研究所）；102号、106-2号（湖北嘉鱼县环宇食用菌研究所）；108号、109号、110号（山东省金乡县菇丰食用菌研究所）；126号（吉林敖东食用菌研究所）；160号（贵州省习水县习酒镇食用菌研究中心）；161号、170号、171号、173号、176号（山东光大食用菌科研中心）。

PC12细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。RPMI 1640培养基、胎牛血清（FBS）、二甲基亚砜（DMSO）、DPPH和2，4，6-三（2-吡啶基）三嗪（TPTZ）均购自美国Sigma公司；0.25%胰蛋白酶购自美国Gibco公司；alamarBlueTM细胞活力检测试剂购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和谷胱甘肽（GSH）检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；BCA蛋白检测试剂盒购自上海碧云天生物技术股份有限公司；生物传感器芯片CM5购自Cytiva公司；Aβ25 35（用于构建PC12细胞损伤模型）和Aβ1 42（用于分子间相互作用位点的探究）购自北京博奥森生物技术有限公司。其他试剂均为国产分析纯。主要仪器设备：BD Accuri C6流式细胞仪（美国BD公司）；IX2-ILL100倒置显微镜（日本Olympus公司）；Biacore X-100生物分子相互作用分析系统（美国GE Healthcare公司）。

在RMPI 1640基础培养基中加入10%（v/v）FBS、100 U/mL青霉素和100µg/mL链霉素，配制成完全培养基，用于细胞传代和保种。在RMPI 1640基础培养基中加入1%（v/v）FBS，配制成试验培养基。

1.2灵芝乙醇提取物制备

参照徐锦等（2020）的方法，略有改进。18种灵芝子实体各取100 g，按照料液比1∶10加入1 L 95%乙醇，热回流提取30 min，将得到的液体进行抽滤，旋转蒸发仪65℃减压蒸馏至一定体积，冻干后得到灵芝醇提物。

1.3利用Aβ25 35建立PC12细胞损伤模型

使用超纯水将5 mg Aβ25 35配制成1 mmol/L储备液，在37℃下培养7 d以诱导聚集。参考徐宾（2019）的方法，将对数生长期的PC12细胞接种至96孔板中，每孔加入浓度为3×104个细胞/mL的细胞悬液100μL，在5%CO2、37℃培养箱中孵育24 h后吸去培养基，在阴性对照组中加入100μL RPMI1640培养基（含1%FBS），模型组建立包括5个损伤浓度梯度，分别在100μL RPMI 1640培养基（含1%FBS）中加入10、50、100、180和360μmol/LAβ25 35，每组6个重复，在37℃下培养48h。

1.4 alamarBlueTM检测灵芝醇提物对PC12细胞增殖的影响

根据汪雯翰等（2018）的方法测定细胞活性，细胞接种数参照方法1.3。灵芝醇提物对PC12细胞的毒副作用试验分组：模型组（100µmol/LAβ25 35）、6个样品组（5、50、500、5000、50000、500000 ng/mL灵芝醇提物）和阴性对照组（5‰DMSO）。各试验组在37℃下培养48 h后，吸去培养基，加入无色RPMI 1640培养基和200μL 0.0075 mg/mL alamarBlueTM试剂，在570和600 nm处测吸光度。根据公式计算灵芝醇提物对PC12细胞的增殖率：

增殖率（%）=［117216×A570nm（样品）-80586×A600nm（样品）］/［117216×A570 nm（对照）-80586×A600 nm（对照）］×100

1.5灵芝醇提物对PC12细胞抗氧化指标的影响

1.5.1 SOD活性测定将细胞悬液密度调整为1×105个细胞/mL，以每孔1 mL接种至12孔板中。24 h后吸去培养基，加入1 mL 50μmol/LAβ25 35继续培养48 h，复制体外AD细胞模型。试验设模型组（50µmol/LAβ25 35）、3个样品组（50、500和5000 ng/mL灵芝醇提物）、阴性对照组（5‰DMSO）和阳性对照组（20μmol/L维生素E），每组4个重复，每孔100μL。胰蛋白酶消化收集PC12细胞，裂解细胞后，4℃下3000 r/min离心10 min，取上清液，使用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度，并使用SOD检测试剂盒测定SOD活性（Cao et al.，2015）。

1.5.2 MDA和GSH含量测定试验分组同1.5.1。采用硫代巴比妥酸显色法和比色法，按照检测试剂盒说明书分别测定MDA和GSH含量。

1.6细胞凋亡试验

参考李传华等（2016）的方法，试验分组同1.5.1。用预冷的PBS洗涤2次，加入100μL结合缓冲液（Annexin V Binding Buffer）与细胞混合，再加入5μL Annexin V和5μL碘化丙啶（PI），在4℃下黑暗孵育15 min。使用流式细胞仪计数10000个细胞，并用FlowJo_V10进行分析。

1.7细胞周期试验

参考汪雯翰等（2017）的方法，试验分组同1.5.1。PC12细胞经试验处理后消化收集，用PBS清洗，1000 r/min离心10 min，弃上清液，用预冷的75%乙醇固定过夜，1000 r/min离心10 min，PBS重悬细胞并进行清洗，离心10min后弃上清液，细胞在室温下用500μL PI/RNase染色液孵育15 min，使用流式细胞仪进行检测，计数10000个细胞，用FlowJo_V10识别细胞各个阶段，包括G0/G1期（第一间隙期，DNA含量不变）、S期（合成期，DNA含量增加）、G2期（第二间隙期）和M期（有丝分裂期），观察细胞阻滞情况。

1.8灵芝三萜化合物活性验证

本研究团队前期基于遗传算法与偏最小二乘法（GA-PLS）建立了灵芝子实体三萜类化合物抗氧化活性谱效关系研究模型，通过此模型发现灵芝酸C2、灵芝酸B、灵芝酸LM2和灵芝醛A是灵芝醇提物有抗氧化作用的主要活性成分（杨妍等，2020）。本研究利用抗氧化能力检测方法（DPPH自由基清除法、铁离子还原/抗氧化能力检测法和ABTS自由基清除法）筛选出抗氧化活性较强的灵芝醇提物样品，比较各样品中灵芝酸C2、灵芝酸B、灵芝酸LM2和灵芝醛A 4种成分的含量占比。在此基础上，进一步利用细胞模型和表面等离子共振（SPR）技术验证结果。

在细胞水平上对4种灵芝三萜化合物活性验证：试验设模型组（100µmol/LAβ25 35）、样品组（0.1、0.2、1、2、10μmol/L灵芝三萜化合物）、阴性对照组（5‰DMSO）和阳性对照组（20μmol/L维生素E），每组4个重复，每孔100μL。各试验组在37℃下培养48h后，吸去培养基，加入无色RPMI 1640培养基和200μL 0.0075 mg/mL alamarBlueTM试剂，在570和600 nm处测吸光度，计算灵芝样品对PC12细胞的增殖率，计算公式同1.4。

SPR技术对4种灵芝三萜化合物活性验证：采用氨基偶联的方法将Aβ1 42肽固定在CM5芯片上，晚期糖基化终产物受体（RAGE蛋白，His-Tag）作为分析物流经Aβ1 42的表面进行结合分析，然后将灵芝酸B、灵芝酸C2、灵芝酸LM2和灵芝醛A混合到RAGE蛋白中，流过Aβ表面，分析结合情况。通过拟合结合曲线获得样品与蛋白之间的亲和力，亲和力大小用KD表示。

1.9统计分析

试验数据以平均值±标准差表示，采用GraphPad Prism 8.0对数据进行统计分析，组间比较通过单因素方差分析（One-way ANOVA）中多重比较完成。

2结果与分析

2.1灵芝醇提物对PC12细胞增殖的影响

在预试验中，通过考察DPPH自由基清除能力、铁离子还原/抗氧化能力及ABTS自由基清除能力，对18种灵芝醇提物进行初步评估，选择在3种检测方法中抗氧化活性较强的6种灵芝醇提物（108、109、106-2、161、171和173）进行细胞水平检测。如图1-A所示，与模型组相比，6种样品均对氧化应激损伤的PC12细胞具有极显著的修复作用（P<0.0 下同），且108、109和106-2样品的修复效果更佳。细胞毒副作用试验结果进一步发现，在50～5000 ng/mL浓度范围内，108、109和106-2样品不影响PC12细胞增殖（图1-B），表明对神经元细胞无明显的毒副作用，因而在后续试验中选用50、500和5000 ng/mL作为样品工作浓度。

2.2灵芝醇提物对PC12细胞抗氧化指标的影响

如图2-A所示，模型组SOD活性较阴性对照组显著下降66.6%（P<0.05，下同），表明在PC12细胞损伤模型中，Aβ25 35诱导的损伤能显著抑制SOD活性；与模型组相比，108样品在3个浓度下显著或极显著提高SOD活性，500 ng/mL 109样品极显著提高SOD活性，但106-2样品在3个浓度下对SOD活性变化均无显著影响（P>0.05，下同）。如图2-B所示，模型组GSH含量较阴性对照组显著下降45.8%；500 ng/mL 106-2样品对GSH含量有显著促进作用，较模型组提高84.1%，500 ng/mL 108样品的GSH含量较模型组极显著提高221.0%，而109样品在3个浓度下均未表现出显著促进GSH含量提高的作用。如图2-C所示，模型组MDA含量较阴性对照组极显著提高52.0%；而3个样品均在一定程度上抑制Aβ25 35引起的MDA含量上升，其中108和109样品在3个浓度下和106-2样品在50 ng/mL浓度下均表现出极显著影响。

2.3灵芝醇提物对PC12细胞凋亡的影响

如图3-A所示，Aβ25 35可明显诱导PC12细胞早期凋亡（Q3象限），样品组均可一定程度缓解细胞凋亡情况发生。其中，模型组凋亡率较阴性对照组极显著增加567.7%；106-2、108和109样品在3个浓度下均极显著降低早期细胞凋亡率；与模型组相比，106-2和108样品在500 ng/mL时对早期细胞凋亡抑制效果最好，能使PC12细胞凋亡率分别降低64.7%和64.1%，而109样品在50 ng/mL时抑制早期凋亡效果最好，可使PC12细胞凋亡率降低68.2%（图3-B）。

2.4灵芝醇提物对PC12细胞周期的影响

如图4所示，Aβ25 35处理将细胞周期阻滞在G2/M期。具体表现为模型组较阴性对照组G2/M期比例增加151.5%；与模型组相比，5000 ng/mL 106-2、50 ng/mL 108和500 ng/mL 109可显著降低G2/M期比例，分别降低11.5%、22.4%和25.5%（表1）。表明灵芝醇提物对Aβ25 35引起的细胞周期紊乱有一定的恢复作用。

2.5灵芝三萜对Aβ25 35诱导PC12细胞氧化应激损伤的影响

利用3种抗氧化方法筛选出抗氧化活性较强的灵芝醇提物108、109、106-2、161、171和173，测定这6种醇提物中三萜类化合物灵芝酸C2、灵芝酸B、灵芝酸LM2和灵芝醛A的峰面积，以峰面积表示其相对含量，比较6种醇提物中4种化合物的相对含量占比，结果发现灵芝醇提物108、106-2和109中4种化合物的平均含量占比相对较高（表2），表明这3种灵芝醇提物抗氧化能力较强。在此基础上，进一步利用细胞损伤模型和SPR技术验证此结果，并探讨其作用机理。

2.5.1灵芝三萜对Aβ25 35诱导PC12细胞损伤的修复作用如图5所示，与阴性对照组相比，模型组的细胞增殖率极显著下降53.4%；在0.1～1μmol/L浓度范围内，灵芝酸B和灵芝酸LM2对Aβ25 35诱导PC12细胞损伤的修复作用呈剂量依赖性，且在1μmol/L浓度下的修复效果最佳，细胞增殖率分别较模型组显著提高50.1%和49.6%；在0.1～10μmol/L浓度范围内，灵芝酸C2和灵芝酸A对Aβ25 35诱导PC12细胞损伤的修复作用呈剂量依赖性，且在10μmol/L浓度下的修复效果最佳，细胞增殖率分别较模型组显著提高58.9%和59.7%。

2.5.2灵芝三萜对Aβ1 42与RAGE结合的抑制作用试验设计如图6-A所示，利用灵芝三萜对Aβ1 42与RAGE结合进行阻碍，并探究灵芝三萜的阻碍作用位点。如图6-B1和图6-B2所示，Aβ1 42与RAGE可紧密结合，KD值为91.74 nmol/L；在灵芝酸C2、灵芝酸B、灵芝酸LM2和灵芝醛A这4种三萜类化合物中，只有灵芝醛A与Aβ1 42具有较强的亲和力（图6-C1和图6-C2），其KD值为15.62μmol/L（图6-D2）；进一步研究发现，灵芝醛A还可通过与Aβ1 42结合来抑制Aβ1 42与RAGE的结合（图6-D1和图6-D3），从而表明灵芝醛A通过与RAGE竞争性结合来减轻或抑制Aβ1 42细胞毒性作用。

3讨论

灵芝中存在着一些具有良好抗氧化活性的化合物，如三萜、多糖和多酚等，这些化合物在减少氧自由基生成、提高抗氧化酶活性和抑制氧化应激反应等方面发挥着重要作用。灵芝醇提物能防止心脏和大脑线粒体中与年龄相关的抗氧化状态下降，从而保护老年小鼠降低ROS水平，延缓衰老过程（Sud-heeshetal.，2010），同时可增加线粒体电子传递复合物和锰超氧化物歧化酶（Mn-SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）等活性，以及提高DPPH和ABTS自由基清除剂的活性（Sud-heeshetal.，2009）。Smina等（2011）评估了灵芝总三萜的体内外抗氧化活性，表明总三萜能有效清除超氧阴离子自由基。灵芝三萜类药物可增加肝脏和脑组织中SOD和CAT活性，保护身体免受氧化应激诱导的蛋白质和脂质过氧化损伤（Smina et al.，2016）。在小鼠帕金森病模型中，灵芝多糖可调节细胞凋亡相关蛋白表达，抑制氧化应激诱导的神经元凋亡，并在小脑颗粒细胞中具有显著的保护作用（Sun et al.，2017）。本研究在预试验的3种抗氧化活性测评模型中，灵芝所有样品对DPPH自由基清除效果最好，而在铁离子还原/抗氧化能力模型中抗氧化作用表现较弱，表明同一样品在不同的抗氧化试验中表现的活性灵敏度并不一致，可能与其含有的成分密切相关；之后将筛选的化合物进行比对，挑选出在3种抗氧化活性测评模型中抗氧化效果均具优势的灵芝醇提物，在建立的Aβ引起氧化应激细胞模型中做进一步筛选，明确了3种修复氧化应激损伤效果较好的醇提物，分别为106-2、108和109。探究这3种样品对PC12细胞的毒性作用，以及对已被Aβ25 35诱导损伤的PC12细胞的修复作用浓度，并检测3种样品对Aβ25 35所致PC12细胞损伤模型的ROS释放、细胞凋亡及周期的变化情况。经体外生化反应与细胞水平的筛选，发现灵芝醇提物可一定程度修复氧化应激损伤。

Aβ是诱导神经元细胞凋亡的主要因素之一，其可破坏脑内氧化还原状态的平衡，促使神经元凋亡，甚至导致脑部病理损伤（Varadarajan et al.，2000）。在多项研究中已有使用11基酸片段的Aβ25 35替

代全长肽Aβ1 42用于AD毒理学研究的相关报道，因为Aβ25 35能模拟天然全长肽的毒理作用和氧化应激特性，且合成相对简单、成本较低（Varadarajanet al.，2001）。本研究在体外经生化反应证实了灵芝醇提物具有良好的抗氧化能力，但考虑到生物体内部的复杂性，在样品抗氧化活性评价试验中，选用细胞模型来评价样品的相关活性，以便对样品活性有更客观的评价。细胞周期、细胞凋亡与氧化应激是细胞生物学研究中重要的3个方面。细胞周期的调控是细胞保持正常功能的重要机制之一。研究表明，灵芝三萜提取物可将细胞周期停滞在G1期（Jedinak et al.，2011；Wu et al.，2012）。除了使细胞周期停滞于G1期外，三萜提取物还能抑制处于G2/M期的细胞（Lin etal.，2003）。Hsu等（2002）报道，灵芝能增强人原代中性粒细胞的吞噬活性和迁移，并在体外主要通过激活Akt调节的信号通路来抑制自发和Fas诱导的中性粒细胞凋亡。灵芝水提取物通过抑制突触素转运、JNK和p38信号通路以拮抗神经元细胞凋亡（Lai et al.，2008）。Lee等（2016）还发现灵芝醇提物通过激活Nrf2/HO-1增强细胞抗氧化防御能力，从而保护C2C12成肌细胞免受H2O2诱导的氧化细胞毒性。本研究通过分析细胞凋亡、细胞周期、氧化还原相关酶活性和MDA含量，发现Aβ25 35处理的模型组使细胞凋亡率增加，并将细胞周期阻滞在G2/M期。3种灵芝醇提物（108、109和106-2）具有减缓氧化应激损伤，缓解细胞周期紊乱，抑制细胞早期凋亡的作用；3种醇提物均能提高SOD活性，说明其能催化超氧阴离子自由基的歧化反应，生成O2和H2O 同时提高GSH含量，抵抗氧化损伤，减少自由基产生，降低细胞液中MDA含量。在提高SOD活性和GSH含量方面，3种灵芝醇提物均有一定的显著作用，说明这3种灵芝醇提物均能发挥良好的神经元保护能力。针对这一结果，本研究利用团队前期通过谱效方程预测得到的灵芝抗氧化活性成分（灵芝酸C2、灵芝酸B、灵芝酸LM2和灵芝醛A），分析3种灵芝醇提物的抗氧化活性，发现4种成分含量占比高的醇提物，其抗氧化活性也较强，与前期预测结果相一致，进一步验证了该预测结果的准确性和可靠性。

许多患者大脑中Aβ沉积是AD发生的标志性特征，而RAGE是介导Aβ细胞毒性的重要受体（Yan et al.，2012），RAGE与Aβ相互作用会导致神经元损伤和血脑屏障功能障碍（Kook et al.，2012）。也有研究表明抗AD活性物质可通过RAGE靶点发挥神经元保护作用。Onyange等（2005）发现RAGE蛋白与Aβ神经毒性密切相关，因而推测具有抑制Aβ1 42与RAGE结合的活性小分子有助于防治AD。Cui等（2017）利用微量热涌动试验评估RAGE与苦参碱的结合亲和力，发现matrine可阻断RAGE配体结合部位，减少促炎细胞因子和Aβ沉积，减轻AD转基因小鼠记忆障碍，表明matrine可通过阻断RAGE V结构域与配体结合而下调Aβ/RAGE信号通路。Guan等（2022）利用siRNA干扰试验发现si-RAGE能明显减轻薯蓣皂苷对氧化应激和炎症的抑制作用，表明薯蓣皂苷可通过调节RAGE/NOX4介导的氧化应激和炎症途径发挥抗AD活性。本研究为进一步探讨灵芝酸B、灵芝酸C2、灵芝酸LM2和灵芝醛A的神经元保护机制，利用SPR技术来验证这4种三萜类化合物相关抗氧化活性是否与RAGE靶点相关，同时考虑到RAGE蛋白与Aβ的相互作用时可能会涉及到较多结合位点，因而选用全长肽Aβ1 42进行试验。研究发现灵芝醛A能通过与Aβ1 42竞争性结合来阻碍Aβ1 42与RAGE结合，预示灵芝醛A能有效抑制Aβ1 42通过RAGE受体进入血脑屏障的累积，从而改善Aβ累积造成的氧化应激。杨妍等（2020）利用谱效关系模型预测了灵芝醇提物抗氧化活性与灵芝酸B、灵芝酸C2、灵芝酸LM2和灵芝醛A存在密切联系，而本研究结果表明这4种化合物通过其良好的抗氧化活性赋予了灵芝醇提物缓解Aβ神经毒性和保护神经元的功效，其中灵芝醛A是通过阻碍Aβ与RAGE结合来减少Aβ的累积。本研究结果可为开发灵芝防治AD相关小分子抑制剂及保健品和功能食品提供数据支撑。有研究表明，通过动物模型抑制RAGE或敲除RAGE基因，均可促进神经退行性疾病治疗过程中获得更好结果（Deane et al.，2012；Deane，2012）。目前还未有针对AD患者的临床RAGE抑制剂，需要更多的体内研究和临床试验，以确保使用新的RAGE拮抗剂对AD动物模型和AD患者进行慢性治疗的有效性。

灵芝作为一种传统的药用真菌，不仅具有抗氧化作用，还可通过减少促炎因子的释放减轻神经炎症，同时抑制乙酰胆碱酯酶活性，从而改善胆碱能神经系统功能；此外，灵芝还能调节神经—内分泌系统，发挥神经保护作用（Cör et al.，2014；王颖等，2019）。本研究通过构建神经元损伤体外模型，对灵芝三萜类化合物的体外抗AD神经保护活性以及相关作用机理进行探究，显示了灵芝的体外抗氧化神经保护功效。然而，由于体外试验的环境与生物体内的复杂条件存在差异，这些试验结果可能无法准确预测化合物或治疗手段在体内的真实效果，因此还需进一步的体内试验来确定其在动物及临床治疗中的有效性和安全性。

4结论

灵芝醇提物的抗氧化神经元活性不依赖于单一化合物，而是通过灵芝酸C2、灵芝酸B、灵芝酸LM2和灵芝醛A 4种化合物的协同效应来实现。4种三萜类化合物中，灵芝醛A能通过与RAGE竞争性结合来减轻或抑制Aβ1 42细胞毒性作用。灵芝具有开发防治AD功能性产品的潜力。

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