ARTP诱变选育维生素K2高产菌株

维生素K2是一类重要的脂溶性维生素，在凝血、抗骨质疏松等方面具有重要作用。为了提升纳豆芽孢杆菌发酵过程中维生素K2（MK-7）的产量，以纳豆芽孢杆菌ND09为出发菌株，采用常压室温等离子体（ARTP）诱变技术进行选育，获得一株MK-7高产突变株，产MK-7含量达到26.42mg/L，为出发菌株的2.1倍。经10代传代培养性能稳定，对其摇瓶发酵装液量、接种量、发酵温度进行优化，MK-7含量最终达到38.7mg/L，为生物发酵生产MK-7提供了有利的微生物资源。

维生素 K2 被称做甲萘醌（Menaquinone，MK），其C3位的侧链是由不同数量的异戊二烯基组成的，存在一系列亚型，可记作 MK-n（n 代表异戊二烯基的个数），其中最为重要的两类亚型是MK-4和MK-7，与其他维生素K2相比，MK-7 在人体中具有半衰期长、亲缘性高的特点，在医药和功能性食品等领域备受关注，并且MK-7是生物活性最高的一种维生素K2。它在食品中含量极少，可以预防和治疗骨质疏松症，有“铀金维生素”之称，主要通过调节体内钙离子的沉积，从而刺激骨组织内骨钙素的合成。此外，MK-7是哺乳动物正常血液凝固时不可或缺的营养素。天然MK-7只能通过微生物发酵法获得，其中，纳豆芽孢杆菌是目前工业化生产MK-7的主要菌种。因为它不仅容易培养、生长速度快，而且产MK-7含量相对高。对于野生型的纳豆芽孢杆菌往往需要进行诱变育种提高产量，从而满足工业化生产的需求。

常压室温等离子体诱变（ARTP）是一种通过在常压和室温下产生等离子体来引发基因突变的技术。ARTP诱变利用高能量等离子体中的化学反应和物理效应，对细胞的DNA进行改变，从而引起基因组的突变。 ARTP作为一种生物育种技术，因其操作便捷、安全、高效的特点，在生物科学领域广泛应用。本实验以前期分离保存的纳豆芽孢杆菌作为出发菌株，旨在筛选得到MK-7产量高且遗传稳定性好的突变菌株，为该菌株能够进一步应用于生产打下基础。

1.材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1材料

纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto），由新拓洋生物工程有限公司技术中心分离并保存（分离自濮阳南堤村发酵型豆酱）。

1.1.2 培养基

平板培养基：胰蛋白胨1%、酵母浸粉0.5%、氯化钠1%、琼脂1.5-2%、pH自然。

种液培养基：胰蛋白胨1%、酵母浸粉0.5%、氯化钠1%、pH自然。

基础发酵培养基：蔗糖50g/L、蛋白胨50g/L、磷酸二氢钾0.5g/L。NaCl 3g/L、pH6.7-7.0、115℃灭菌20min。

1.1.3 试剂

MK-7标准品（≥99.8 %）：Sigma；异丙醇、甲醇（色谱纯）：美国 TEDIA 公司；其他试剂均为分析纯。

1.1.4 仪器与设备

常压室温等离子体诱变育种仪（ARTP-M 型，无锡源清天木生物）；高压蒸汽灭菌锅（LS-75HD，江阴滨江医疗设备有限公司）；高效液相色谱仪（Agilent 1260、Santa Clara、CA、USA）；高速冷冻离心机（GL-21M，湘仪离心机仪器有限公司）；分析天平（赛多利斯）。SBA-40E生物传感分析仪（山东省科学院生物研究所）。

1.2 试验方法

1.2.1 种子培养

从融化的冷冻管中蘸取1环，划线于平板培养基，37℃，培养过夜。用接种环挑选单菌落，接种于50/250mL种液摇瓶中，37℃200rpm，培养6-10h。

1.2.2 诱变方法

1.2.2.1 纳豆芽孢杆菌生长曲线的测定

按1.2.1进行种子培养，使用分光光度计在600nm下每隔1h测定OD值，用无菌液做为对照，用菌液培养时间、OD值分别为横坐标和纵坐标，绘制生长曲线。

1.2.2.2 菌悬液的制备

取对数生长期的种子液在4000r/min转速下离心5min收集菌体，将菌体用灭菌后的生理盐水重悬清洗两次，得到菌悬液后，将菌数调整到105-106CFU/mL供诱变使用。

1.2.2.3 菌株诱变

开启ARTP系统并对操作室内外消毒，取1.2.2.3所制菌悬液10ul于载片，按无菌操作放至操作室台面。在一定的照射距离及气流量下，分别采用诱变时间10s、20s、30s、40s、50s、60s进行诱变。诱变结束后，洗脱菌液至无菌生理盐水中至1000ul。之后将菌液稀释，涂布平板在37 ℃培养箱内培养24h。依据致死率，确定合适的ARTP处理时间。

1.2.2.4 致死率的测定

用稀释涂布平板法对诱变处理前后的菌液进行培养，并计数。

致死率（%）= （A－B）/A×100

A：未经诱变处理的菌落数，B：诱变处理后存活的菌落数。

1.2.3 摇瓶发酵培养

从摇瓶种液中转接1mL种液于40/250mL无挡板发酵摇瓶中，37℃，220rpm遮光培养，定时取样测定各指标。

1.2.4 MK-7的检测

取发酵液0.5mL于5mL棕色离心管中，加入萃取剂（异丙醇：正己烷的混合物=1：2）2mL涡旋搅拌机用力摇匀10min，静置至两相分离，吸取上层有机相，用HPLC分析。配备光电二极管阵列紫外检测器和C18 ODS柱（5µm、250×4.6mm、Thermo Fisher Scientific、Waltham、MA、USA），柱温40℃，流动相用甲醇：二氯甲烷（9：1，v/v），流速1mL/min，检测波长254nm，进样量10µL。MK-7校准曲线在1mg/L-100mg/L之间呈线性变化。

MK-7含量=液相结果×3.5（最终有机相体积约为发酵液的3.5倍）。

1.2.5 诱变菌株的遗传稳定性

将筛选获得的菌株连续传代培养10代，并对每一代菌株按1.2.3进行培养，比较每代菌株发酵MK-7含量变化，以评估菌株的遗传稳定性。

1.2.6 发酵工艺优化实验

1.2.6.1 摇瓶装液量对发酵的影响

将培养好的种子液按3%接种量接种于250mL锥形瓶中，装液量设置为：10 mL、20 mL、30 mL、40 mL、50 mL，培养72h后检测发酵液MK-7含量。

1.2.6.2 接种量对发酵的影响

接种量按1%、2.5%、5%、7.5%、10% ，分别接种于装有20 mL基础发酵培养基的250mL锥形瓶中（低于10%接种量的补加无菌水至10%），培养72h后检测发酵液MK-7含量。

1.2.6.3 培养温度对纳豆芽孢杆菌ND09产MK-7的影响

将培养好的种子液按5%接种量接种于装有20mL基础发酵培养基的250mL锥形瓶中，分别在30℃、34℃、37℃、40℃、43℃培养，72h后检测发酵液MK-7含量。

1.3 数据处理

各实验设置三个平行，试验数据采用 Microsoft Excel 2019 数据处理系统进行整理及分析。

2.结果与分析

2.1 纳豆芽孢杆菌的生长曲线

根据纳豆芽孢杆菌ND09的生长曲线（图1），我们可以观察到不同生长阶段的特征。前4小时处于迟滞期，4-8小时是对数生长期，8-12小时是生长稳定期。针对ARTP实验需要，我们希望选择处于对数生长的中后期的菌液作为实验对象。因此，我们决定收集第6小时的菌液进行诱变实验。这个时间点对应了纳豆芽孢杆菌ND09的对数生长的中后期，有利于诱发变异并保持菌株的生长状态。

2.2 致死率曲线

表1可以看到，随着ARTP诱变处理时间的延长菌株致死率持续升高，我们选择致死率80%-85%的处理时间定为ARTP的诱变剂量，故诱变时间确定为40s。

2.3 诱变菌株的筛选

ARTP诱变后从平板上挑选出92个形态较好的单菌落，分别接斜面固体培养基进行扩培，再分别进行摇瓶发酵培养，筛选产量高的菌株。筛选到正突变株15株，突变株ND09-A6产量达到26.2 mg/L，高于其他突变株，确定对其进一步研究。

图2 突变株的筛选

2.4 突变株稳定性分析

为了评价突变菌株ND09-A6遗传稳定性，将其连续10次传代培养，并进行摇瓶发酵检测MK-7产量。以未经传代的ND09-A6的MK-7产量为基准计算变化率，结果见表2。从表中可以看到ND09-A6菌株的各代MK-7产量保持在26mg/L左右，各代的变化率在±4%以内。表明该菌株具有较好的遗传稳定性。

2.4.1 摇瓶装液量对MK-7含量的影响

根据实验结果（表3），发现装液量为20mL时，MK-7的产量最高，随着装液量的增大呈先增大后减小的趋势。可能是因为ND09-A6菌株属于需氧菌，若装液量过大会造成发酵过程中溶氧偏低，而装液量过小水分蒸发会导致菌体早衰。故确定装液量为20mL。

2.4.2 接种量对MK-7含量的影响

由表4可以看到，随着接种量的增大MK-7的产量趋势先增大后减小。接种量为5%时，MK-7的产量最高。可能接种量过大会使营养物质快速消耗，而接种量过小会影响菌体内某些辅酶扩散，这些都不利于MK-7的合成，故选择接种量为5%。

2.4.3 温度对 MK-7含量的影响

由表5可知，MK-7的产量随着温度的增大呈先增大后减小的趋势，温度为 40℃时，MK-7含量最高，这可能是由于40℃是MK-7合成关键酶的最适反应温度，更有利于MK-7合成。

结论

以实验室保存的ND09为出发菌株进行ARTP诱变选育，ARTP诱变处理最佳时间为40s。经过多次筛选，最终获得1株MK-7高产菌株ND09-A6，并连续传代10次进行摇瓶发酵培养，MK-7的发酵含量平均 26.42mg/L，达到出发菌株的 2.1倍。然后对发酵条件接种量、装液量、温度进行优化，优化后最佳发酵条件为：接种量5%，装液量20mL，培养温度40℃，培养72h后发酵液中MK-7含量达到了38.7mg/L。本实验表明，采用本研究中的菌种诱变方法选育出的高产菌株ND09-A6具有良好的遗传稳定性，对发酵条件进行优化后显著提高了MK-7含量。若要全面提高菌株的发酵水平，还需要对菌株进行一定的改造，对培养基配方和发酵工艺进一步优化，从而应用于工业化生产。

作者简介

杨林（1982.10-），男，汉族，河北保定人，本科，工程师；研究方向：发酵工程。

*通讯作者

张建国（1972.11-），男，汉族，河南驻马店人，本科，高级工程师；研究方向：生物化工。