包装饮用水中常见致病菌及检测方法

1.引言

包装饮用水包括饮用天然矿泉水、饮用纯净水和其他类饮用水，是符合食品安全标准和相关规定的包装容器中密封的，可供消费者直接饮用的水。伴随我国居民生活水平不断提高，包装饮用水的需求量逐年增加。但同时水是致病菌传播的重要媒介，不安全的饮用水会引发多种健康问题。《食品安全国家标准 饮用天然矿泉水》（GB 8537-2022）是国家为保障居民饮用水安全的强制性技术文件，具有法律效力。由于水中致病菌具有丰度低、种属多、耐药性高和致病性不同等特点，对致病菌的监测与管控要求较高，对新型检测技术的开发与应用需求迫切。

目前政府机关针对包装饮用水（含矿泉水）的微生物检测方法主要依据《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》（GB 4789.3-2016）、《食品安全国家标准饮用天然矿泉水检验方法》（GB 8538-2016），采用培养法进行计数与监测，人工需求量大，耗时长。随着近年相关研究的发展，分子生物学检测技术因其灵敏、特异、简便、省时省力等优点，在水环境中致病菌的鉴定与检测中扮演着重要角色。本文对目前包装饮用水中主要致病菌及其导致的疾病进行总结，重点介绍了近年来针对饮用水中致病菌检测的各项检测技术，并横向比较，以期为发现与推广高效便捷的致病菌检测方法提供理论基础。

2.包装饮用水中致病菌及相关疾病

包装饮用水虽然通过了严格的净化程序，但仍有污染风险。查阅资料可知，国内外现行食品安全标准中规定的矿泉水未检出菌包括：总大肠菌群（Coliform group）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）、产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）、和军团菌（Legionella）。

2.1 总大肠菌群

总大肠菌群是指需氧或兼性厌氧，在37℃条件下能将乳酸分解并产酸产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌，包括肠杆菌属、大肠埃希氏菌属等，在自然环境中普遍存在。由于总大肠菌群广泛寄生在温血动物肠道内，在体外存活时间以及对消毒剂的抵抗力与肠道致病菌相近，因此长期作为水质污染的指示菌使用，也是水体中有无致病菌的间接指标。

总大肠菌群中部分种属为条件致病菌，能引起肠道感染性疾病，表现多为腹泻、腹痛。

2.2 铜绿假单胞菌

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），为非发酵专性需氧革兰阴性杆菌，是一种常见的条件致病菌，又名绿脓杆菌，广泛存在于潮湿环境。铜绿假单胞菌通过形成生物膜的方式，黏附在生物体或非生物材料表面，以应对不良环境，并进行菌体的散播和定殖。中国质量新闻网数据显示，近年来，超过半成的包装饮用水不合格产品为致病菌不合格，且多为铜绿假单胞菌检出。

铜绿假单胞菌是能够令免疫系统受损的条件致病菌，多影响人体呼吸系统、消化系统等部位，在特定条件下可引起呼吸系统、泌尿系统、创伤面等部位感染，甚至能引起急性或慢性感染，严重时可引起脓毒血症、败血病和细菌血症。

2.3 粪肠球菌

粪肠球菌（Enterococcus faecalis），旧名粪链球菌，为兼性厌氧型革兰氏阳性球菌。菌体形态多为球状或链状，无荚膜、无芽孢，对环境的适应力和抵抗力强，可耐受多种抗生素，可以作为新近粪便污染的指示菌。

目前，对食源性粪肠球菌耐药性和毒力基因等比对分析研究相对较少，粪肠球菌由于其对抗生素的耐受性和对环境的抵抗力，多见于院内感染，引起食源性疾病暴发的较罕见且多表现为腹泻、腹痛。

2.4 产气荚膜梭菌

产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）为革兰氏阳性专性厌氧杆菌，无鞭毛。产气荚膜梭菌多以芽胞形式存在于自然界中，也存在于人、动物及其肠道中，是肠道的正常菌群之一，是典型的粪便污染指示菌。

产气荚膜梭菌是一种条件致病菌，可产生多种外毒素，食源性摄入会导致食物中毒、腹泻、肠炎和肠毒血症，孢子或繁殖体侵染伤口或进入动物体内可致气性坏疽。产气荚膜梭菌毒力强、繁殖速度快、生存力强且能够高效定植，严重危害人类和公众健康，威胁公共安全。

2.5 军团菌

军团菌 （Legionella）是一类需氧革兰氏阴性胞内寄生杆菌，是广泛存在于各类水体与土壤环境中的条件致病菌。水体中的微生物能够为军团菌提供必要的营养并保护军团菌抵抗消毒剂，且军团菌本身对消毒剂有较强的抵抗力，因此军团菌在以自来水为基础的生活用水管网中易爆发。但包装饮用水经过紫外灭菌过程后密封，含气体量少且没有宿主细胞，军团菌缺乏生长繁殖的空间，因此至今未有包装饮用水导致军团菌病的案例。

3.饮用水中致病菌的检测技术

近年来，随着我国经济发展向好，政府对食品安全、环境保护等方面重视程度增加，同时我国分子生物学领域的高速发展，饮用水及水环境中致病菌的检测方面研究取得了一定的进展，从单一的传统致病菌培养检测方法发展至多种引入分子生物学技术的新兴检测方法。

3.1 培养法

目前，我国现行针对包装饮用水的微生物检测方法为基于培养法的滤膜法与酶底物法。滤膜法是将水样通过特定孔径的滤膜过滤，然后将滤膜移至选择性琼脂培养基上培养后产生特定代谢产物，从而得到检测结果。酶底物法是指将水样在特定条件下培养后，依据指定菌产生的酶可以分解选择性培养基中的荧光底物而产生荧光的原理进行检测。

培养法经过长期实践应用认可，相对偏差较小，具有高度稳定性，但检测耗时费力、操作过程繁琐复杂、对操作人员和操作环境有较高要求，在实际应用过程中有一定的局限性。

3.2 PCR法

在饮用水中的致病菌检测领域，PCR法是目前应用最广的分子生物学方法之一。相对传统培养方法，PCR通过变性、退火和延伸三个过程，扩增特定的靶基因序列，实现对致病菌的检测，用时短、人工操作少，能够将检测时间从4-7d缩短为2d，且用可批量进行的DNA提取过程和荧光PCR检测过程代替人工挑选，再培养及多种生化鉴定。《中华人民共和国出入境检验检疫行业标准》（SN/T 1896-2007）中，PCR技术已经明确被用于对食品中的数种致病菌进行快速定性检测。

荧光定量PCR法（qPCR法）是将荧光标记引入PCR反应体系，通过实时监测携带荧光标记的特异性引物与目标DNA结合产生的荧光信号来获得产物的扩增曲线。由于qPCR法特异性高、灵敏度高、耗时短且能够准确定量，qPCR法在致病菌检测领域受到广泛关注。目前，有团队通过对引物和探针进行优化，使qPCR法克服了仅能测定单一致病菌的缺点，使qPCR法的应用潜力进一步提升。但是，qPCR法无法识别活菌或死菌，可能产生假阳性结果。当反应体系存在PCR抑制物时，易出现假阴性结果，目前只能通过改变反应环境解决以上问题。

3.3 等温扩增技术

等温扩增技术包括环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification method， LAMP）和重组酶等温扩增（Recombinase polymerase amplification， RPA）检测技术，主要通过添加不同活性的酶和特异性引物快速扩增核酸，是新近适用于检测食源性和环境病原体的分子生物学检测方法。

其中，LAMP是基于Bst.DNA聚合酶的链置换特性实现的在恒定温度下进行的快速多引物扩增技术，成本低、操作简便、无需借助大型仪器、特异性强、灵敏度高较PCR高，但存在引物设计复杂、产物容易引发气溶胶污染和假阳性频率高的缺点。

RPA是针对痕量核酸模板上的目的基因的恒温条件扩增，具有检测时间极短、灵敏度极高的特点。该方法已具有成熟的商业试剂盒，对操作人员技术要求低、检测结果可视化，非常适用于实地检测，具有较大的应用前景。

3.4 生物传感器

生物传感器（biosensor）是能够将分析物浓度转化为特定信号来检测生物或化学反应的装置，由生物受体识别元件和信号转换元件构成，可根据受体识别元件和信号转换元件的类型不同大致分为光化学生物传感器和电化学生物传感器。

生物传感器技术能够对反应进行定量、连续、实时的监测，且信号读取方便，易于商品化，对操作人员和环境要求较低，能够低成本、大范围、快速检测。在食品和环境领域的微生物检测中有广阔的应用前景。但现存生物传感器缺乏对于食源性微生物选择性高的受体识别元件，使用寿命较短，仍需发展。

3.5 DNA微阵列技术

DNA微阵列技术是将在玻片上固定的大量dsDNA分子作为探针，与大量的DNA分子和DNA结合蛋白之间的相互作用，通过模拟DNA结合转录因子在体内与相应结合位点的相互作用，并产生标记物，实现对特定DNA片段的鉴定，也被称为DNA芯片。

微阵列技术检测通量极大，可实现对大量菌种的同时检测。但该技术检测限较高，灵敏度较低，对样品中致病菌的丰度有较高的要求。同时，微阵列制备过程中，对程序设计和制备系统的要求很高，对转录因子蛋白的纯度和数量有较高要求，对反应的生化环境限制大。

4.结语与展望

本文通过对包装饮用水中常见的致病菌及现行检测方式进行综述，可以发现，近年来，等温扩增、PCR等分子生物学方法已经广泛应用于实验室环境下饮用水致病菌检测中，并发挥了重要作用。目前，各类高通量测序技术在致病菌的定性与定量领域的应用处于高速发展阶段，基于分子生物学的高效、灵敏、准确的致病菌检测技术将是未来致病菌检测领域的新星。如何将各项技术稳定、低成本、广泛、自动化地投入一线使用，如何实现检测对象由指示菌和少数肠道病原菌到不可培养和新出现的致病菌的转变，是该领域未来研究的重点。

同时，针对包装饮用水水源污染程度低、密闭性好、运输储存时间长等特点，在对包装饮用水中致病菌进行检测时，相较于传统的对操作环境要求较高的培养法，检测所需时间较短的分子生物学方法显然准确性更高。但在菌群检测的准确性上，基于分子生物学的检测方法仍需要大量实验验证，并不断更新技术与标准，与传统卫生学方法有机结合。

第一作者

张淑琪（2003-），女，汉族，河南开封人，本科在读；专业：生物科学。

*通讯作者

朱振洪（1971.10-），男，汉族，湖北黄冈人，副教授，博士；研究方向：生化与分子生物学。