血清miRNA液体活检在早期卵巢癌诊断中的临床价值

张伟锋 舒艳 万择秋

[摘要] 目的 探讨血清微RNA（microRNA，miRNA）液体活检在早期卵巢癌诊断中的临床价值。方法 选取2021—2023年湖州市妇幼保健院的22个新鲜冷冻Ⅰ期卵巢癌组织和9个相邻正常卵巢组织用于本研究。使用R软件中的limma软件包分析肿瘤和邻近正常组织之间miRNA的差异表达。利用公开的回顾性血清miRNA测序数据集GSE106817使用Ⅰ期卵巢癌中高表达的miRNA训练Logistic回归模型，使用GSE113486和GSE31568验证模型的准确性。结果 Ⅰ期卵巢癌组织中共筛选出8种高表达miRNA，即miR-182、miR-183、miR-202、miR-205、miR-508、miR-509-3、miR-513B和miR-513C。在训练队列GSE106817中用于诊断卵巢癌的曲线下面积（area under the curve，AUC）为0.89。在验证队列GSE31568和GSE113486中诊断卵巢癌的AUC分别为0.85和0.86。结论 血清miRNA液体活检对早期卵巢癌的诊断有较高的临床价值。

[关键词] 微RNA；液体活检；早期卵巢癌

[中图分类号] R711.75；R446.11      [文献标识码] A      [DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2024.16.011

Clinical value of serum miRNA liquid biopsy in the diagnosis of early ovarian cancer

ZHANG Weifeng， SHU Yan， WAN Zeqiu

Department of Gynecology and Obstetrics， Huzhou Maternal and Child Health Care Hospital， Huzhou 313000， Zhejiang， China

[Abstract] Objective To investigate the clinical value of serum microRNA （miRNA） liquid biopsy in the diagnosis of early ovarian cancer. Methods Twenty-two fresh and frozen stage I ovarian cancer tissues and nine adjacent normal ovarian tissues from Huzhou Maternal and Child Health Care Hospital from 2021 to 2023 were selected for this study. Differential expression of miRNA between tumors and adjacent normal tissues was analyzed using limma software package in R software. The published retrospective serum miRNA sequencing dataset GSE106817 was used to train the Logistic regression model with highly expressed miRNA in stage Ⅰ ovarian cancer， and GSE113486 and GSE31568 were used to verify the accuracy of the model. Results A total of 8 highly expressed miRNA were selected from stage Ⅰ ovarian cancer， namely miR-182， miR-183， miR-202， miR-205， miR-508， miR-509-3， miR-513B and miR-513C. The area under the curve （AUC） for diagnosing ovarian cancer in the training cohort GSE106817 was 0.89. The AUC for diagnosis of ovarian cancer in validation cohorts GSE31568 and GSE113486 was 0.85 and 0.86， respectively. Conclusion Serum miRNA liquid biopsy has high clinical value in the diagnosis of early ovarian cancer.

[Key words] MicroRNA; Liquid biopsy; Early ovarian cancer

卵巢癌是女性常见的生殖系统肿瘤之一，也是女性第五大死亡原因。据报道，全球每年约32万新发卵巢癌病例，近20万人死亡[1]。由于卵巢癌早期没有明显症状，70%以上的女性诊断时已为晚期（Ⅲ或Ⅳ期），5年总生存率低于40%，而Ⅰ期卵巢癌患者的5年生存率可达90%[2]。因此，早期诊断对提高卵巢癌患者的总生存率具有重要意义。尽管盆腔检查和经阴道超声检查是诊断卵巢肿瘤的标准方法，但它们并不是很敏感。目前，血清糖类抗原125水平检测是研究最多的卵巢癌筛查方法，但其对早期卵巢癌患者的特异性和敏感度并不高。此外，由于卵巢是腹膜内器官，只有活检才能确认卵巢癌的诊断。然而，早期卵巢肿瘤应避免穿刺活检，以防因穿刺造成肿瘤细胞向腹腔扩散和转移。因此，迫切需要一种非侵入性、稳健和可靠的卵巢癌早期筛查、诊断方法。

近年来，在肿瘤筛查中，液体活检正逐渐取代侵入性组织活检。与传统的肿瘤组织活检相比，液体活检具有无创、多次采样和同时检测多种肿瘤等优点[3]。液体活检主要检测细胞外RNA[4-6]。微RNA（microRNA，miRNA）是一类小分子非编码RNA，长度18～24个核苷酸，可调节基因表达。细胞分泌的miRNA稳定存在于细胞外小泡中，或与蛋白质或脂质结合，因此不易在组织、血液、粪便和其他体液中降解，是肿瘤筛查的理想生物标志物。尽管多项研究已证明miRNA在血清中作为卵巢癌生物标志物的适用性，但大多数筛查的卵巢癌均处于晚期，而非早期卵巢癌[7-9]。此外，大多数研究中的miRNA筛选并不是基于无偏见的全基因组miRNA测序数据。因此，本研究旨在建立并验证1种基于血清miRNA液体活检预测早期卵巢癌的模型，从而探讨血清miRNA液体活检在早期卵巢癌无创筛查和诊断中的临床价值。

1  资料与方法

1.1  一般资料

选取2021—2023年湖州市妇幼保健院的22个新鲜冷冻Ⅰ期卵巢癌组织和9个相邻的正常卵巢组织用于探讨血清miRNA液体活检对早期卵巢癌患者的诊断价值，排除标准：①非早期卵巢癌；②转移性卵巢癌；③卵巢交界性肿瘤；④接受过抗肿瘤治疗的患者。本研究经湖州市妇幼保健院医学伦理委员会审查通过（伦理审批号：2021-R-002），所有患者和家属均知情同意。

1.2  不同miRNA的筛选

对组织样本进行全基因组miRNA水平测序。使用R软件中的limma软件包分析肿瘤和邻近正常组织之间miRNA的差异表达。筛选差异表达miRNA的标准是log2倍变化大于2，且错误发现率（false discovery rate，FDR）校正的P<0.05。根据上述标准，共筛选出8种在Ⅰ期卵巢癌组织中特异性高表达的miRNA。

1.3  基于血清miRNA的诊断模型的构建

由于miRNA在组织和血清中的动态表达水平不同，从基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus，GEO数据库）下载一组公开可用的回顾性血清miRNA测序数据集GSE106817，其中包括卵巢癌（n=320）和正常对照（n=320）。使用筛选出的8种Ⅰ期卵巢癌高表达miRNA训练血清学诊断的Logistic回归模型，以预测卵巢癌风险的概率。卵巢癌风险概率=–1.3774+（0.0887×miR-202）+（0.1622×miR-508）+（0.3776×miR-509-3）+（–0.0381×miR-205）+（0.1101×miR-182）–（0.1038×miR-513C）+（0.0690×miR-183）+（0.2317×miR-513B）。

1.4  验证模型的准确性

从GEO数据库下载2个公开可用的回顾性血清队列miRNA数据集进行验证（GSE113486和GSE31568）。通过受试者操作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC曲线）评估模型预测风险概率的准确性，使用“pROC”软件包中的约登指数确定ROC曲线的最佳阈值。

1.5  统计学方法

使用R软件（4.1.2版）进行统计分析。limma软件包用于训练集的差异表达分析，FDR校正通过Benjamini Hochberg方法进行。采用多元Logistic回归方法构建卵巢癌诊断模型。ROC曲线和曲线下面积（area under the curve，AUC）用于评估模型的预测效果。P＜0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1  不同miRNA的筛选

通过差异分析Ⅰ期卵巢癌组织和正常组织的miRNA表达谱，发现143种不同的miRNA。在143种miRNA中，筛选出8种在Ⅰ期卵巢癌组织中高表达的miRNA，即miR-182、miR-183、miR-202、miR-205、miR-508、miR-509-3、miR-513B和miR-513C，见图1。

2.2  诊断模型的构建和验证

在训练队列GSE106817中诊断卵巢癌的AUC为0.89，见图2A。数据集GSE31568和GSE113486用于验证模型的准确性，结果显示其诊断卵巢癌的AUC分别为0.85和0.86，见图2B、图2C。

3  讨论

卵巢恶性肿瘤具有典型的组织学和分子学异质性，通常在晚期被诊断。尽管肿瘤根治性手术治疗效果较前明显改善，但仍有50%的卵巢癌患者存在复发或转移，导致整体预后不良[11]。基因特定位点有望成为潜在的生物学检测靶点[12]。卵巢癌的早期诊断和治疗对提高患者生存率十分重要。研究发现miRNA在卵巢癌诊断中极具潜力[13-14]。本研究建立1个基于miR-182、miR-183、miR-202、miR-205、miR-508、miR-509-3、miR-513B和miR-513C的多变量Logistic回归模型。该模型诊断卵巢癌的AUC达0.89。在2个公开的队列中验证该模型诊断卵巢癌的效果，表明该模型对早期卵巢癌具有良好的诊断价值。与文献报道大体一致。

miRNA在调节各种生物过程中发挥着至关重要的作用，包括但不限于分化、细胞增殖、应激反应和细胞凋亡。血清中存在的miRNA来源于肿瘤组织，这使得血清miRNA具有作为肿瘤生物标志物的潜力。miRNA与肿瘤的发生和发展密切相关，故有必要对miRNA与卵巢癌的相关性进行更广泛的研究。

在卵巢癌中，Wang等[15]发现miR-182通过直接和负调控程序性细胞死亡而参与细胞生长、侵袭和化疗耐药。一项基于GEO数据库的生物信息学分析研究表明，miR-182可调节卵巢癌的分子网络，对其生物学进程至关重要[16]。而miR-183在卵巢癌中上调，并通过转化生长因子-β/Smad4信号通路调节细胞增殖和凋亡。miR-183在卵巢癌的诊断中具有较高的敏感度和特异性[17]。据报道，miR-202-5p通过靶向HOXB2抑制卵巢癌的细胞增殖、迁移和侵袭[18]。外泌体miR-205可通过调节血管内皮生长因子A调控卵巢癌细胞的生物进程或抑制PTEN/Smad4表达[19]。研究证实miR-508-3p和miR-509-3对卵巢癌的预后和治疗有一定价值[20-21]。下调miRNA-513在卵巢癌中可发挥肿瘤抑制作用。

综上，基于血清miRNA（miR-182、miR-183、miR-202、miR-205、miR-508、miR-509-3、miR-513B和miR-513C）液体活检的诊断模型对早期卵巢癌患者的诊断具有较高的临床价值。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。

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（收稿日期：2023–11–09）

（修回日期：2024–04–21）