一例肉鸡网状内皮组织增生症病毒与圆圈病毒混合感染的实验室诊断

胡峰 武蕾蕾 吴静 李玉峰

摘 要：黑龙江地区某养殖场，28日龄商品肉鸡出现精神萎靡，采食量下降，生长缓慢的症状，发病鸡在眼、鼻、喙部位出现溃疡结痂。病鸡剖检病理变化主要是腺胃出血、乳头肿胀，肾脏肿大、脾脏出血坏死、法氏囊萎缩、肠炎等，病原学核酸检测结果表明该鸡场存在禽网状内皮组织增生症病毒和圆圈病毒3型的混合感染。本病例的实验室诊断为家禽疫病防控提供了部分理论基础和有效参考。

关键词：网状内皮组织增生症病毒；圆圈病毒；混合感染；实验室诊断

中图分类号：S858.31文献标识码：B文章编号：1673-1085（2024）06-0012-05

网状内皮组织增生症（Reticuloendotheliosis，RE）是由网状内皮组织增生症病毒（Reticuloendotheliosis virus， REV）引起的以免疫抑制、矮小综合征和肿瘤形成为特征的一群病理综合征[1]。REV感染宿主范围广，可以感染鸡、鸭、鹅、野生鸟类[2]。RE是迄今已确定的禽类重要的免疫抑制性疾病，可垂直传播，呈世界性分布[3]。目前，在我国养禽业面临的一个重要问题就是禽类反转录病毒（禽白血病病毒和REV）感染造成的鸡群免疫抑制，进而易于继发其他疾病[4]。同时由于REV可污染疫苗造成免疫失败，在鸡群中的危害正日趋严重，给养禽业的健康发展造成巨大的挑战[5]。

圆圈病毒（Gyrovirus，GyVs）是环状单链DNA 病毒，属于细环病毒科，圆圈病毒属[6]。据报道，在人的皮肤、腹泻患者的粪便以及发病鸡中均可检测到GyVs[6，7]。目前，已有研究报道圆圈病毒3型（GyV-3）与鸡传染性腺胃炎存有一定的关系[8]，且在鸡群中的感染呈上升趋势。另外，GyV-3既可以感染鸡，也可以感染哺乳动物小鼠，存在一定的公共卫生风险[9]。

本研究针对送检的疑似病例，结合发病鸡临床症状，利用分子生物学检测技术，确定该病例为REV和GyV-3双重感染，具体报告如下。

1  材料与方法

1.1  样品背景

黑龙江地区某养鸡场，28日龄商品肉鸡出现精神萎靡，采食量下降，生长缓慢的症状，发病鸡在眼、鼻、喙部位出现溃疡结痂。剖检可见腺胃出血、腺胃乳头肿胀、肾肿、脾出血坏死、法氏囊萎缩、肠炎等病变。

1.2  样品处理

发病鸡心脏、肺脏、肝脏、腺胃、脾脏等脏器与灭菌生理盐水按1：5的比例混合，匀浆打碎制成混悬液，反复冻融3次，10 000 r/min离心10 min，取上清，利用病毒DNA/RNA提取试剂盒提取病毒核酸。

1.3  PCR检测

针对家禽常见的免疫抑制病、呼吸道疾病以及已报道的鸡腺胃炎等相关疾病设计并合成引物，利用PCR或RT-PCR分子生物学检测方法进行病原检测。PCR反应体系和RT-PCR反应体系参照2 ×Taq PCR StarMix和2 × ES One-Step Reaction Mix试剂盒说明书进行配制。PCR反应条件是94 ℃预变性120 s，94 ℃变性30 s，52 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，扩增35个循环，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。RT-PCR反应条件是45 ℃反转录30 min，94 ℃预变性120 s；94 ℃变性20 s，52 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，扩增35个循环，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后观察，并根据扩增目的基因片段大小判定结果。

1.4  鸡胚试验

将1.2中制备的组织病料混悬液，10 000 r/min离心10 min，取上清，青链霉素（各1万IU/mL）作用2 h后，过滤除菌，经绒毛膜途径接种10日龄SPF鸡胚，每天观察鸡胚生长状况。

2  结果

2.1  病理解剖与病变观察

病鸡精神萎靡，采食量下降，生长缓慢，在眼、鼻、喙部位出现溃疡、出血、结痂，剖检主要眼观病理变化为腺胃出血、腺胃乳头肿胀、肾肿、脾出血坏死、法氏囊萎缩、肠炎等，见图1。

2.2  实验室PCR检测结果

以1.2中提取的病毒DNA/RNA为模板，利用实验室设计的特异性引物，按照1.3中PCR反应体系及反应条件进行病原核酸检测，分别扩增出大小380 bp（REV）和330 bp（GyV-3）的特异条带，与预期的目的条带一致，而针对其它常见病毒的引物均未扩增出特异条带，同时结合鸡群临床症状、剖检病变，该病例为REV和GyV-3混合感染，其它病原为阴性，电泳结果见图2。

2.3  鸡胚致病性分析

制备的病料混悬液无菌处理后，吸取0.2 mL，经绒毛膜途径接种10日龄SPF鸡胚。结果显示接种72 h后，开始出现死亡，死亡鸡胚发育不良，通体有出血点，肝脏出血坏死，心肌有出血点、肾脏肿大，结果见图3。

3  讨论

近年来随着家禽养殖规模的扩大和养殖密度的增加，鸡传染性腺胃炎在鸡群中不断发生，特别是对肉鸡产业影响较大，临床症状主要表现为鸡生长不良、消瘦、肠炎、腺胃肿大、腺胃乳头水肿等[10]。该病上个世纪90年代首次在中国出现，随后得到国内外学者的普遍关注[11]。该病不同病例的临床症状、病理变化表现存在一定差异，且致病病因不明确，加之没有有效的治疗药物，发病后给养鸡场造成较大损失。目前，针对鸡传染性腺胃炎的致病原因较复杂，主要包括传染性因素和非传染性因素两方面。传染性因素主要是从发生腺胃炎的病例中分离到的病毒，如REV、ALV、MDV、CAV、GyV-3、IBV、C-REOV、IBDV、FAV、FPV等，非传染性因素主要包括饲料营养不平衡、饲料霉变、生物胺等化合物[12]，但目前仍无法证明上述任何一种致病因素能对腺胃炎的发生起决定性作用。本研究根据发病鸡临床症状及病理剖检特征进行常见病原检测，检测结果显示为REV和GyV-3的混合感染。已有研究报道，在发生腺胃炎的鸡群中存在CAV和GyV-3的混合感染，双重感染率为18.18%，另外研究发现发病鸡群中还存在CAV、ALV 和GyV-3的三重感染（感染率为7.07%）以及CAV、ALV、鸡细小病毒和GyV-3的四重感染（感染率为1.34%）[13]，但目前还没有关于REV和GyV-3混合感染的报道。目前，针对GyV-3已建立了荧光定量PCR和普通PCR检测方法，但随着GyV-3与其它病原混合感染的不断发生，急需建立高通量的多病原混合感染的检测方法，以更好地开展流行病学调查，进一步了解GyV-3与其它病原之间的协同作用对鸡群的影响。

本研究首次报道了鸡场发生腺胃炎的病例中存在REV和GyV-3的混合感染。REV和GyV-3感染鸡后都会产生免疫抑制，造成其它疾病疫苗的免疫失败，降低鸡群的抵抗力，进而导致鸡群多种病毒病和细菌病的发生。另外，发病鸡在眼、鼻、喙部位出现溃疡、出血、结痂，虽然症状与鸡痘病毒感染类似，但本研究中并没有检测到鸡痘病毒。因此，该鸡场发病鸡的临床表现是否是REV和GyV-3协同作用的结果仍需进一步深入的研究。针对鸡传染性腺胃炎，目前没有特别有效的药物用于治疗。一方面， REV属于反转录病毒，在复制过程中其基因组需要整合到宿主基因组中，因此由其制备的弱毒疫苗存在一定的生物安全风险。另一方面，REV在体外培养较困难，病毒增殖慢，培养周期长，滴度低，所以灭活疫苗的研制存在较大困难。同样，目前GyV-3也缺乏合适的体外增殖宿主，疫苗研发也存在较大困难。针对REV和GyV-3，目前没有商品化的疫苗用于免疫预防。因此，该病应以预防为主，养殖场应加强日常管理，定期消毒，发现疑似病例立即隔离淘汰，保证鸡群日粮品质和营养均衡，提高鸡群免疫力，避免传染性因素和非传染性因素等致病诱因的发生。另外，袁世玉[14]研究表明GyV-3可以跨物种感染哺乳动物小鼠，在小鼠之间水平传播，并造成胃肠炎和贫血。因此，对GyV-3的研究和防控还具有潜在的公共卫生意义。

参考文献：

[1]  SHI M， LI M， WANG P， et al. An outbreak in three-yellow chickens with clinical tumors of high mortality caused by the coinfection of reticuloendotheliosis virus and Marek's disease virus： a speculated reticuloendotheliosis virus contamination plays an important role in the case[J].Poult Sci，2021， 100（1）：19-25.

[2]  CALEIRO GS， NUNES CF， URBANO PR， et al.Detection of Reticuloendotheliosis Virus in Muscovy Ducks， Wild Turkeys， and Chickens in Brazil[J]. J Wildl Dis， 2020， 56（3）：631-635.

[3]  CHAC?N RD， SEDANO-HERRERA B， ALFARO-ESPINOZA ER， et al. Complete Genome Characterization of Reticuloendotheliosis Virus Detected in Chickens with Multiple Viral Coinfections[J]. Viruses，2022，14（4）：798.

[4]  LI M， WANG P， LI Q， et al. Reemergence of reticuloendotheliosis virus and Marek's disease virus co-infection in Yellow-Chickens in Southern China[J]. Poult Sci， 2021，100（8）：101099.

[5]  FADLY A， GARCIA MC. Detection of reticuloendotheliosis virus in live virus vaccines of poultry[J].Dev Biol （Basel）， 2006，126：301-327.

[6]  CHU DK， POON LL， CHIU SS， et al. Characterization of a novel gyrovirus in human stool and chicken meat[J]. J Clin Virol， 2012，55（3）：209-213.

[7]  PHAN TG， DA COSTA AC， ZHANG W， et al. A new gyrovirus in human feces[J].Virus Genes， 2015，51（1）：132-135.

[8]  LI G， YUAN S， HE M， et al. Emergence of gyrovirus 3 in commercial broiler chickens with transmissible viral proventriculitis[J]. Transbound Emerg Dis， 2018，65（5）：1170-1174.

[9]  YUAN S， YAN T， HUANG L， et al Cross-species pathogenicity of gyrovirus 3 in experimentally infected chickens and mice[J]. Vet Microbiol， 2021，261：109191.

[10]  YAN T， LI G， ZHOU D， et al. Long read sequencing revealed proventricular virome of broiler chicken with transmission viral proventriculitis[J]. BMC Vet Res， 2022，18（1）：253.

[11]王永坤，朱国强，田慧芳，等.鸡传染性腺胃病的研 究[J].江苏农学院学报，1996（01）：52.

[12]吴佳宁.鸡传染性腺胃炎的最新研究进展[J].北方牧业，2022（18）：31-32.

[13]陈长福.2021年福建省龙岩市病死鸡群中4种病毒感染情况调查[J].中国动物检疫，2022，39（02）：15-20.

[14]袁世玉.圆圈病毒3型（GyV3）对鸡和小鼠致病特性研究[D].泰安：山东农业大学，2020.

Laboratory Diagnosis of Mixed infection of Reticuloendotheliosis Virus and Gyrovirus in Broilers

HU Feng1， WU Leilei2， WU Jing1， LI Yufeng1*

（1.Poultry Institute， Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan 250100， China; 2. Shandong Xintai Animal Husbandry and Veterinary Development Service Center， Xintai 271200， China）

Abstract： The 28-day-old commercial broilers showed signs of malaise， loss of appetite and slow growth in a farm in Heilongjiang province. The infected chickens showed ulceration in the eyes， nose and beak. The mainly pathological changes of the infected chickens were hemorrhage and swelling of the glandular stomach， swelling of the kidneys， hemorrhage and necrosis of the spleen， atrophy of the bursa of fabricius， enteritis， etc. The results of etiological diagnosis showed that there was a mixed infection of avian reticuloendotheliosis virus and gyrovirus 3 in the chicken farm. The laboratory diagnosis of this case provides part of the theoretical basis and effective reference for the prevention and control of poultry disease.

Keywords： reticuloendotheliosis virus; gyrovirus; mixed infection; laboratory diagnosis