饲料中乙烯雌酚含量的检测方法研究

李东　单晓丽　周峰

摘 要：本研究旨在开发一种高效、经济的方法，利用高效能液相层析仪（HPLC）配合光二极管侦测器（PDA），对饲料中乙烯雌酚含量进行分析。为了避免在低浓度情况下的误判，同时采用高效液相层析质谱仪（HPLC/MS）进行了再确认。在实验中，饲料样品以甲醇为萃取液，经过振荡、离心、浓缩上清液，残渣用70%甲醇溶解，通过Oasis?HLB卡匣去除干扰物质，最后用甲醇进行冲提，冲提液经高效液相层析仪检测。实验结果表明，对于饲料添加0.5、1、3、5 ppm的情况，回收率在80.8%到107.5%。仅采用光二极管侦测器检测时，最低检测限为0.03 ppm；而采用质谱侦测器检测时，最低检测限可达0.005 ppm。研究结果表明，所开发的高效液相层析仪饲料中乙烯雌酚检测方法具有便捷、经济、可行的特点，可作为饲料中乙烯雌酚检验的一种有效方法。

关键词：乙烯雌酚，高效能液相层析仪（HPLC），光二极管侦测器（PDA），饲料分析，液相层析质谱仪（LC/MS）

DOI编码：10.3969/j.issn.1002-5944.2024.10.034

0 引 言

乙烯雌酚是由英国内科医师查尔斯 多兹（CharlesDodds等）于1938年开发的一种合成雌激素。由于其比天然雌激素具有更强的效果、生产成本低、口服方便等优点，因此被广泛用于预防流产、早产以及减轻更年期障碍症状[1]。在农业方面，由于乙烯雌酚对牛、鸡和绵羊具有显著的促进生长和提高饲料利用率的作用，自1941年起曾广泛应用。

近年来，气相层析质谱仪（GC/MS）检测乙烯雌酚的方法得到了广泛应用。然而，由于GC/MS的前处理过程繁琐，需要经过衍生化后才能进行检测，因此液相层析质谱仪（LC/MS）检测方法成为新的发展趋势[2]。尽管质谱仪具有高灵敏度、高分辨率和专一性等优点，但由于其昂贵的价格和高昂的维护费用，如果应用于例行检测业务，相对成本也较高。因此，本研究尝试开发一种以广泛应用的高效能液相层析仪结合光二极管侦测器的方法，用于分析饲料中的乙烯雌酚含量，并通过质谱仪进行再确认[3]。本实验的目的在于开发一种更为便捷和经济的方法，以检测饲料中乙烯雌酚的含量，以便应用于饲料查验管理，预防乙烯雌酚的违法使用，确保畜产品的安全和消费者的健康。

1 材料及方法

1.1 仪器设备及器材

溶液输送系统及自动采样注射器：Alliance2695；

光二极管侦测器：Water s 29 9 6 Photodiode Array Detector；

质谱侦测器：ZQ4000；

层析资料处理系统：Waters Empower Software分析管柱：Atlantis?C185μm，4.6x150mm超音波振荡器：BRANSON8510；

离心机：KUBOTA5010；

减压浓缩机：HEIDOLPH WB2001/VV2011；

固相萃取匣：Oasis?HLB 3cc/60mg Extractioncartridge。

1.2 标准品及试药

标准品：diethylstilbestrol；

溶剂：甲醇、蒸馏水。

1.3 检量线制作

（1）将乙烯雌酚标准品以甲醇稀释成浓度为10 0 μg /mL的标准原液。取适量的标准原液，以甲醇分别稀释成0.25、0.5、1、3、5 μg /mL等5种浓度的工作液，H PLC / PDA分析条件的移动相为methanol∶H2O＝65∶35，流速设定为1 mL/min，侦测波长为240 nm，每种浓度注入20 μL，重复分析三次，测定波峰面积以制作检量线。

（2）取适量的标准原液，以甲醇分别稀释成0.005、0.01、0.05、0.1、0.5 μg/mL共5种浓度，HPLC/MS分析条件设定为ESI Negative Mode的离子模式，准分子离子峰（SIR）为「M-H」-267，Capillary Voltage为3.3 kV，Cone Voltage为35 V，每种浓度重复分析3次，制作一检量线。

1.4 饲料中乙烯雌酚分析

取空白饲料，添加乙烯雌酚，使饲料中乙烯雌酚的含量分别为0.01、0.05、0.1、0.5、1、3、5 ppm。各组饲料分别取5 g（3份）加入40 mL甲醇，置于超音波震荡器震荡30分钟后，离心10分钟（3000 rpm），取上清液减压浓缩至干，以70%甲醇5 mL溶出。取2 mL的溶出液注入Oasis?HLB3 cc/60 mg卡匣内（预先以3 mL甲醇活化及3 mL水平衡），以3 mL70％甲醇洗净后，再以甲醇2 mL冲提，冲提液经0.45 μm滤膜过滤后，注入液相层析仪测定。

2 结 果

根据上述分析条件以HPLC/PDA分析乙烯雌酚标准品5种浓度（0.25、0.5、1、3、5 μg/mL），所得结果由层析结果中可见于波长240 nm下，滞留时间9.49分钟有一明显吸收峰。波峰面积的相对标准偏差介于0.4％～3.4％之间，检量线Y=552.5+66247.2X，线性系数为r 2=0.99998（见表1）。

检量线 Y=552.5+66247.2X；

相关系数 r 2=0.99998。

以H P L C / M S 分析乙烯雌酚标准品5种浓度（0.0 05、0.01、0.05、0.1、0. 5 μg /mL），所得结果由质谱结果显见其吸收峰，检量线的相关系数r 2 = 0 . 9 9 8 5，波峰面积的相对标准偏差为1.62%～10.60%（见表2）。

检量线Y=191502.1+37690.2X

相关系数r 2=0.9985

最低检测界限及最低定量界限依公式LOD=3.3σ/S及LOQ＝10σ/S（式中σ为回归线在y轴的截距的标准差，S为分析物检量线的斜率），可得最低检测极限为0.028 ppm，最低定量极限为0.084 ppm。

饲料中添加乙烯雌酚0.5、1.0、3.0、5.0 ppm4种浓度，依上述分析条件与饲料前处理方法处理分析后，结果显示其平均回收率为80.8％～107.5%，相对标准偏差为0.8%～6.0%（见表3）。

于空白饲料添加乙烯雌酚0.05 ppm，经饲料前处理以LC/PDA/MS侦测结果，由以SIR（Select IonRecording）267侦测特定分子量的质谱，相较于所得的层析，发现运用质谱仪检测时，可减少噪声干扰，降低侦测极限。

饲料中乙烯雌酚的浓度虽有添加至0.1、0.05、0.01 ppm，但由分析所得结果发现，以HPLC/PDA侦测时仅能准确定量至0.5 ppm，为避免低浓度所造成误判的困扰，遂以HPLC/MS进行检测。在质谱仪检测下，可准确定性至0.01 ppm。

3 讨论

本实验主要应用固相萃取技术进行饲料的前处理，然后以高效能液相层析仪配合光二极管侦测器进行检测饲料中乙烯雌酚的含量。本实验参考Alda D L J M ，Barceló D，2001与Y M ，2000所使用的C18 Vac及Oasis? HLB[4]二种固相萃取卡匣进行试验后，发现SPE C18 Vac回收率为84.2%，Oasis?HLB回收率为99.7%，这表明在此条件下Oasis? HLB滞留效果较C18Vac为佳。另外也曾尝试运用不同极性溶剂（如乙氰、乙醚、丙酮、氯仿等）萃取饲料中乙烯雌酚，结果发现当使用的溶剂极性愈低时，会同时将饲料中油脂萃取出，导致净化困难，因此在考虑去油脂与相关有机溶剂的环保问题下，遂选用甲醇作为萃取液。在饲料前处理过程中减压浓缩步骤应是影响本次实验回收率的主因，未来可尝试使用大容量的固相萃取匣直接进行净化，减少浓缩回溶所造成的损失，应可再提高回收率。

本实验最初以HPLC/ PDA检测饲料中乙烯雌酚含量，于结果显示饲料中添加乙烯雌酚浓度愈低时，其回收率反而愈高，推测可能因药品浓度愈低，相对基质的干扰也愈低所致，如加强样品前处理，去除干扰物质，回收率应可获得改善。

饲料中添加乙烯雌酚经前处理后，以LC/PDA/MS侦测结果，可发现于低浓度时运用质谱仪检测，不仅可减少噪声干扰，降低侦测极限，亦可避免造成误判。虽然应用质谱仪检测时可明显见其吸收峰，但由于经离子化过程的变异因子如温度、气体流速等影响，导致侦测结果的重复性不佳，波峰面积相对标准偏差大于10%，如要准确定量仍须添加内标准品加以校正，以达准确的定量结果。

4 总 结

本研究致力于发展一种经济高效的方法，利用高效能液相层析仪（HPLC）结合光二极管侦测器（PDA），对饲料中的乙烯雌酚含量进行准确测定。乙烯雌酚因其在农业中促进生长的作用而曾被广泛使用。本研究采用固相萃取技术进行饲料前处理，以甲醇为溶剂，通过HPLC/PDA进行初步分析，并结合质谱仪进行再确认，旨在确保畜产品的安全性和消费者的健康。

在实验中，通过选择适宜的固相萃取卡匣（Oasis? HLB），优化溶剂和萃取步骤，提高了乙烯雌酚的回收率。HPLC/PDA分析结果表明，所建立的检量线具有良好的线性关系和重现性。同时，通过引入HPLC/MS技术，成功降低了噪声干扰，提高了检测的敏感性，尤其在低浓度范围内的准确性得到了显著提升。

通过在饲料中添加不同浓度的乙烯雌酚进行分析，验证了该方法在实际应用中的可行性。实验结果显示，该方法的最低检测限为0.028 ppm，最低定量限为0.084 ppm。对于添加乙烯雌酚的饲料样品，所获得的平均回收率为80.8％～107.5%，相对标准偏差为0.8%～6.0%，证明了该方法的可靠性和稳定性。

总体而言，本研究成功地利用HPLC/ PDA和HPLC/MS相结合的方法，对饲料中乙烯雌酚进行高效、经济、准确的检测。该方法为饲料查验管理提供了一种可行的手段，确保了畜产品的安全性，维护了消费者的健康。

参考文献

[1]RU I T ER A F C ， ACK ERMA NS M T， EN DERT E .Simultaneous gas chromatographic determination ofconcentration and isotopic enrichment of fatty acids in humanplasma using flame ionization and mass spectrometricdetection[J]. Journal of chromatography. B， Biomedicalsciences and applications， 2001， 759（1）： 169-174.

[2]A L DA M J L D， BA RCELO D. Use of solid-phaseextraction in various of its modalities for sample preparationin the determination of estrogens and progestogens insediment and water[J]. Journal of Chromatography A， 2001，938（1）： 145-153.

[3]RODRIGUES-MOZAZ S， ALDA M J L D， BARCELOD. Monitoring of estrogens， pesticides and bisphenol Ain natural waters and drinking water treatment plants bysolid-phase extraction–liquid chromatography–massspectrometry[J]. Journal of Chromatography A， 2004，1045（1）： 85-92.

[4]MARTIN Y. Determination of three anabolic compounds incalf urine by liquid chromatography with photodiode-arraydetection[J]. The Analyst， 2000， 125（12）： 2230.

作者简介

李东，本科，工程师，研究方向为玻璃纤维增强塑胶、肥料、饲料、化工产品、食品、食用农产品检验检测。

（责任编辑：张瑞洋）