宿主上皮细胞非编码RNA调控隐孢子虫感染的分子机制研究进展

邵天人,吴善博,张雅芳,谢静静,赵利杰,孙露露,边啸坤,王荣军

(河南农业大学 动物医学院,河南郑州 450046)

隐孢子虫(Cryptosporidium)是仅次于轮状病毒感染引起2岁以下儿童腹泻和死亡的第二大病因,对免疫抑制病人也具有很大的威胁,是艾滋病检测指标之一[1]。动物普遍感染隐孢子虫,可导致幼龄动物严重腹泻和死亡,严重影响畜牧业健康发展[2]。隐孢子虫属内具有广泛遗传多态性,已鉴定出47个有效种及70多个隐孢子虫基因型,其中微小隐孢子虫(Cryptosporidiumparvum)是最为重要的人兽共患虫种[3-4]。目前,治疗隐孢子虫病尚未有特效药物或疫苗,只有硝唑尼特被美国食品药品监督管理局批准使用,但仅能缓解中度感染的儿童和免疫正常人群的症状,对人免疫缺陷病毒(HIV)感染者无效[5]。

哺乳动物细胞中存在大量非蛋白质编码RNA转录本,即所谓的非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)。这些非编码RNA种类繁多,根据表达和功能可分为2类,即管家非编码RNA和调控性非编码RNA。管家非编码RNA是细胞生存所必需的,含量较为恒定,呈组成型表达,也称为组成型非编码RNA[6]。调控性非编码RNA主要可分为3类,即内源性的微小RNA(microRNA,miRNA)、长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)和环状RNA(circular RNA,circRNA),其表达具有明显的时空特异性,通常呈短暂表达,对转录、翻译等过程起调节作用[7]。研究发现,宿主上皮细胞ncRNA在防御隐孢子虫感染的先天免疫反应中发挥重要作用,包括抗菌肽的产生、细胞因子/趋化因子的表达、上皮细胞源外泌体的释放、免疫同型趋化酶的反馈调节、炎症反应等[8]。本文综述了宿主上皮细胞miRNA、lncRNA和circRNA在防御隐孢子虫感染过程中的作用机制。

1 miRNAs

miRNA是一类长度约20～23个核苷酸的非编码单链RNA分子,可与靶标mRNA结合并使mRNA降解或阻碍其翻译,从而抑制靶基因的表达[9]。芯片分析及RNA-sequencing分析显示,C.parvum感染诱导上皮细胞miRNA表达谱发生改变,且miRNA在对抗C.parvum感染的先天免疫防御过程中发挥重要功能[10]。

1.1 Let-7i

研究表明,let-7家族成员let-7i在抗隐孢子虫感染过程中通过各种调节机制进行精密调控。例如,C.parvum感染以MyD88/NF-κB依赖的方式降低宿主细胞let-7i表达,这一过程参与了C.parvum感染诱导的上皮细胞Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)表达上调以促进TRL4介导的抗C.parvum的防御反应[11]。O'Hara S P等[12]利用培养的胆管上皮细胞(H69),发现C.parvum感染在降低let-7i表达和启动子活性的同时促进调控序列中NF-κB 亚单位p50-C/ ebp β沉默子复合体的形成,从而阻遏复合体结合到let-7i启动子并促进组蛋白h3去乙酰化。此外,let-7i下调可缓解miRNA介导的NAD 依赖性去乙酰化酶sirtuin-1(SIRT1)翻译抑制以调节NF-κB的活化[13]。这些均提示let-7i表达的转录调控在上皮细胞抵御隐孢子虫感染的先天性免疫反应中的新作用。

1.2 miRNA-98

细胞因子诱导的Src同源蛋白2(CIS)是新兴的胞内蛋白家族,已成为各类细胞中细胞因子反应的关键生理调节因子[14]。Hu G等[15]在C.parvum感染的H69细胞中检测到miR-98表达下调并赋予H69细胞CIS表达,并通过CIS过表达和siRNA干扰试验证明CIS可增强人NF-κB抑制蛋白α(IκBα)降解,促进C.parvum感染后H69细胞中NF-κB的活化。由此表明,miRNA 对CIS表达的调节可能在上皮细胞对微生物挑战反应的TLR/NF-κB信号的反馈调节中发挥重要作用。

1.3 miRNA-513

炎症刺激下H69细胞可表达几种B7共刺激分子,其中B7-H1是一种新发现的B7成员,在细胞介导的免疫应答中发挥关键调节作用[16]。Gong A Y等研究表明,miR-513参与促炎细胞因子IFN-γ诱导的胆管细胞中B7-H1表达;在C.parvum感染的H69细胞中发现miR-513表达下调并缓解miRNA介导的B7-H1翻译抑制,且B7-H1的表达参与了胆管细胞与T细胞之间的相互作用[17]。因此,miR-513在胆管细胞中对C.parvum诱导B7-H1表达的调节作用可能与C.parvum感染相关的胆汁免疫应答反应有关。

1.4 miRNA-27b

一氧化氮(NO)曾被证明在上皮细胞对C.parvum的防御过程中发挥作用[18]。研究表明,C.parvum感染后以NF-κB依赖的方式诱导上皮细胞产生NO,并参与miRNA介导的诱导型NO合酶(iNOS)mRNA的稳定[19]。具体而言,C.parvum感染可引起宿主上皮细胞iNOS mRNA稳定性增强,从而促进感染细胞中NO的产生。有趣的是,iNOS mRNA稳定的潜在机制与KH型剪接调节蛋白(KSRP)的抑制有关,且miR-27b可靶向KSRP 3'UTR导致翻译抑制使C.parvum感染负荷降低。由此表明,miR-27b通过靶向KSRP调节C.parvum感染后iNOS mRNA稳定性可能与一般上皮细胞抗微生物防御的调节有关。

1.5 miR-424-503

miR-424和miR-503是由X染色体上miR-424-503基因位点编码的成熟形式[20]。组蛋白去乙酰化酶(HDAC)具有免疫调节活性,在宿主抗微生物防御过程中发挥重要作用[21]。趋化因子CX3CL1(也称为fractalkine)是CX3C家族的独特成员,它仅与其受体 CX3CR1结合,并且是其受体的独特配体。Zhou R等[22]的研究揭示了HDACs和NF-κB信号在C.parvum感染后上皮细胞趋化因子CX3CL1在表达调控中的新作用,即HDACs和NF-κB信号通过抑制miR-424-503基因调节上皮细胞表达CX3CL1的表达,以促进黏膜上皮细胞对C.parvum感染的防御。

1.6 miR-942-5p

研究表明,miR-942-5p的差异表达参与调节C.parvum感染后宿主上皮细胞免疫应答,且C.parvum依赖TLR2/TLR4-NF-κB信号通路上调人结直肠腺癌(HCT-8)细胞中miR-942-5p的表达[10,23]。为探索miR-942-5p在C.parvum诱导的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)介导的HCT-8细胞凋亡调控中的作用,Xie F等[24]在C.parvum感染早期检测到miR-942-5p表达上调且缓解了miRNA介导的IFI27翻译抑制,而IFI27下调通过TRAIL依赖途径调节细胞凋亡从而影响C.parvum感染负荷。该研究结果揭示了一种新的miRNA在宿主体内抗C.parvum感染的上皮细胞防御反应机制。

1.7 miR-181d

微阵列分析结果显示,miR-181d在C.parvum感染的HCT-8细胞中差异表达[10]。Feng R等[25]在C.parvum感染早期HCT-8细胞中检测到miR-181d表达显著下调,而TLR2、TLR4、NF-κB和参与TLR/NF-κB信号通路的myD88显著上调。为了更深入研究宿主miRNA在C.parvum感染固有免疫反应中的作用,qPCR和Western blot证实C.parvum通过p50亚基依赖的TLR2/ TLR4-NF-κB信号通路下调HCT-8细胞中miR-181d的表达。

2 LncRNA

长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是由RNA聚合酶II转录而来的副产物,主要以RNA的形式参与X染色体沉默、基因组印记、染色质修饰以及转录激活和干扰等多种重要的调控过程[26]。研究发现,一些lncRNA可在先天性免疫细胞中被诱导表达,且很可能在先天防御的调控中发挥关键作用[27]。目前有关lncRNA在寄生虫领域的作用机制研究较少,因此进一步深入了解其相关作用机制十分重要。

2.1 LncRNA-NR_045064

鉴于lncRNA在肠上皮细胞抗微生物防御中的作用,Li等[28]对C.parvum感染后肠上皮细胞中lncRNA表达谱进行测序,其中由NF-κB信号控制的lncRNA NR_045064显著上调。另外在功能上,诱导NR_045064表达可增强感染细胞中部分防御基因的转录并抑制C.parvum感染负荷,且表观遗传组蛋白修饰和p300/MLL相关染色质重塑均参与该过程。因此,lncRNA可能代表了肠上皮细胞抗C.parvum感染防御机制的一种新型调节臂。

2.2 LncRNA-XR_001779380

全基因组转录分析结果显示,C.parvum感染的IEC4.1细胞中表现出lncRNA表达谱的显著改变,其中IncRNA XR_001779380是上调差异最为显著的基因之一[28]。IFN-γ是上皮细胞抗C.parvum防御的关键效应分子[29]。PRDM1作为一种转录抑制因子,可与活化信号传导及转录激活蛋白1(signal transducer and activator of transcription,STAT1)的蛋白抑制剂相互作用,调节STAT1介导的基因转录[30]。研究显示,XR_001779380与PRDM1的相互作用减弱了IFN-γ诱导的STAT1/SWI/SNF相关染色质重塑,从而抑制了IFN-γ介导的新生儿肠上皮细胞防御[31]。这些结果表明,XR_001779380是IFN-γ介导的基因转录和年龄相关的肠上皮细胞抗C.parvum防御的重要调节因子。

2.3 LncRNA-NR_033736

有研究揭示了隐孢子虫感染肠上皮可引起强烈的Ⅰ型IFN反应[32]。同时,Li等[33]在C.parvum感染的肠上皮细胞中鉴定出lncRNA NR_033736可组装成ISGF3复合物并抑制Ⅰ型IFN介导的基因转录。有趣的是,NR_033736本身的上调是由Ⅰ型IFN信号触发的,且NR_033736可调节上皮细胞抗隐孢子虫防御。由此表明,上调NR_033736通过抑制Ⅰ型IFN控制的基因转录对Ⅰ型IFN信号通路进行负反馈调节,从而有助于上皮细胞对微生物感染的固有防御做出微调。

3 CircRNA

环状RNA(circular RNA,circRNA)是一种不含5′帽或3′polyA尾的共价闭环分子,不同于传统线性RNA,它主要在细胞中充当海绵体吸附miRNA,从而解除miRNA对其靶基因的抑制作用[34]。宿主circRNA的差异表达是由各种病原体感染所引起,包括细菌、病毒和寄生虫等[35]。研究表明,隐孢子虫感染可诱导HCT-8细胞中circRNA表达谱显著变化,这一发现具有深远意义[36]。然而,却很少有研究报道有关circRNA在隐孢子虫感染中的调控机制。

微阵列分析结果显示,C.parvum感染后HCT-8细胞中共178个circRNA差异表达,其中hsa_circ_0001946_CBC1(ciRS-7,也称为CDR1as)显著上调近8倍[37]。RelA(也称为p65)是NF-κB信号通路的一个亚基,可防止上皮细胞发生凋亡从而有益于寄生虫繁殖[38]。另一研究显示,miR-1270是ciRS-7高度匹配的miRNA并直接靶标relA,且ciRS-7通过调节miR-1270/relA轴影响NF-κB通路以促进C.parvum繁殖[39]。这些研究均为实施针对隐孢子虫感染的调控策略提供了新视角。

4 展望

ncRNA是生命科学领域发展最迅速的前沿领域之一,其中miRNA、lncRNA、circRNA被称为“RNA三宝”,受到研究者们广泛关注。近些年来,宿主上皮细胞ncRNA在防御隐孢子虫感染的先天免疫反应中的作用机制不断被报道,但多数研究集中于miRNA,有关lncRNA和circRNA的研究较少。随着研究的不断深入,终将阐明上皮细胞ncRNA调控隐孢子虫感染的分子机制,揭开lncRNA、miRNA、circRNA、mRNA之间相互作用以及ceRNA调控网络的神秘面纱,为设计开发隐孢子虫诊断试剂、抗隐孢子虫病药物和疫苗等提供新的理论基础。