饲料中添加褐藻寡糖对脊尾白虾免疫能力的影响

史文军 王学江 李 峰 刘正一 迟 艳 张志凯 黎慧 王李宝 孙林 万夕和 秦松

摘要：為了探究饲料中添加褐藻寡糖（AOS）对脊尾白虾（Exopalaemon carinicauda）免疫和抵抗二尖梅奇酵母（Metschnikowia bicuspidate）能力的影响，试验设置4个不同褐藻寡糖添加量处理，分别为0 mg/kg（CK）、500 mg/kg（T1）、1 000 mg/kg（T2）和2 000 mg/kg（T3），在相同条件下饲养60 d。结果表明：T2处理脊尾白虾的终末质量、总质量增长率和特定生长率极显著高于CK（P＜0.01）；T3处理脊尾白虾存活率极显著高于CK（P＜0.01）。相较于CK，T2处理脊尾白虾肝胰腺中SOD活性、肝胰腺和肌肉中ACP活性、肝胰腺和肌肉中AKP活性、肝胰腺中PO活性均极显著提高（P＜0.01）。T1处理LGBP基因在脊尾白虾肝胰腺中相对表达量极显著高于CK（P＜0.01），T2处理SOD、LGBP基因在脊尾白虾肝胰腺中相对表达量均极显著高于CK（P＜0.01），各处理LZM、SR和CTSB基因在脊尾白虾肝胰腺中相对表达量与CK均无显著差异（P>0.05）。表明饲料中添加1 000 mg/kg褐藻寡糖可以有效提高脊尾白虾体内部分抗氧化和免疫相关基因的表达量，提高脊尾白虾的抗氧化水平和免疫能力。基因相对表达量检测结果与酶活性检测结果一致。攻毒试验中，T1、T2和T3处理脊尾白虾存活率在第3～5 d均极显著高于CK（P＜0.01），但各处理脊尾白虾最终存活率和CK相同，表明褐藻寡糖对二尖梅奇酵母MQ2101具有一定的防控作用，但并不能提高感染后的最终存活率。

关键词：脊尾白虾；褐藻寡糖；二尖梅奇酵母；免疫能力

中图分类号：S917.4文献标识码：A文章编号：1000-4440（2024）04-0698-13

Effects of alginate oligosaccharides supplementation on immunity of Exopalaemon carinicauda

SHI Wen-jun1，2，3，WANG Xue-jiang4，LI Feng4，LIU Zheng-yi1，3，CHI Yan4，ZHANG Zhi-kai4，LI Hui2，WANG Li-bao2，SUN Lin1，WAN Xi-he2，QIN Song1，3

（1.Yantai Institute of Coastal Zone Research， Chinese Academy of Sciences， Yantai 264003， China；2.Jiangsu Institute of Oceanology & Marine Fisheries， Nantong 226007， China；3.University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100049， China；4.Wuzhoufeng Agricultural Science & Technology Co.， Ltd.， Yantai 264000， China）

Abstract：In order to investigate the effects of alginate oligosaccharides （AOS） on the immunity and resistance of Exopalaemon carinicauda to Metschnikowia bicuspidate， four treatments were set up， the addition levels of AOS were 0 mg/kg （CK）， 500 mg/kg （T1）， 1 000 mg/kg （T2） and 2 000 mg/kg （T3）， respectively. The shrimps were fed under the same conditions for 60 days. The results showed that the terminal weight， total weight growth rate and specific growth rate of Exopalaemon carinicauda of T2 treatment were significantly higher than those of CK （P＜0.01）， and the survival rate of Exopalaemon carinicauda of T3 treatment was significantly higher than that of CK （P＜0.01）. Compared with CK， the SOD activity in hepatopancreas， ACP activity in hepatopancreas and muscles， AKP activity in hepatopancreas and muscles， and PO activity in hepatopancreas of Exopalaemon carinicauda of T2 treatment were significantly increased （P＜0.01）. The relative expression level of LGBP in hepatopancreas of Exopalaemon carinicauda of T1 treatment was significantly higher than that of CK （P＜0.01）. The relative expression levels of SOD and LGBP in hepatopancreas of Exopalaemon carinicauda of T2 treatment were significantly higher than those of CK （P＜0.01）. The relative expression levels of LZM， SR and CTSB genes in hepatopancreas of Exopalaemon carinicauda were not significantly different from those of CK （P>0.05）. The results showed that the addition of 1 000 mg/kg alginate oligosaccharides in the diet could effectively increase the expression of some anti-oxidation and immune related genes， and enhance the anti-oxidation level and immune ability of Exopalaemon carinicauda. The results of relative gene expression were consistent with the results of enzyme activity detection.  In the challenge experiment， the survival rate of Exopalaemon carinicauda in T1， T2 and T3 treatments was significantly higher than that in CK （P＜0.01） in 3-5 d. But the final survival rate of Exopalaemon carinicauda in each treatment was the same as that in CK， which indicated that alginate oligosaccharides could prevent and control Metschnikowia bicuspidate MQ2101， but could not improve the final survival rate after infection.

Key words：Exopalaemon carinicauda；alginate oligosaccharides；Metschnikowia bicuspidate；immunity

脊尾白虾（Exopalaemon carinicauda）隶属于甲壳亚门（Crustacea）、十足目（Decapoda）、长臂虾科（Palaemonidae）、白虾属，又名小白虾、五须虾，是中国特有的经济虾类之一[1]。由于其肉质细嫩、味道鲜美，生长速度快、繁殖能力强、适应性广，且具有较高的经济价值，在江苏沿海地区被快速推广养殖[2]，目前江苏省养殖面积和产量均居全国首位。然而近些年一种被当地养殖户称为“僵尸病”的新疾病在江苏省沿海脊尾白虾养殖区开始流行，本课题组前期已经开展了该病的流行病学和病原学研究，分离纯化出致病原，致病原鉴定为二尖梅奇酵母（Metschnikowia bicuspidata），命名为MQ2101[3]。目前有关二尖梅奇酵母的致病机制及其在养殖环境中的感染传播途径、具体的防治措施都尚不明确。当脊尾白虾出现“僵尸病”典型症状时，已经进入感染后期，患病虾活动减少且不再摄食，这增加了该病的治疗难度。因此在脊尾白虾养殖过程中需要加强预防意识，深入贯彻防大于治的原则。

脊尾白虾属于无脊椎动物，不具有获得性免疫系统，主要依靠先天性免疫系统中的细胞免疫和体液免疫来抵抗外源病原体的侵染。细胞免疫主要是依靠血淋巴进行吞噬和包囊等一系列过程，血细胞中的半颗粒细胞主导包囊过程，颗粒细胞介导机体的凝集作用，同时它们也参与吞噬作用[4-5]。体液免疫主要包括抗氧化酶系统、酚氧化酶原激活系统和一些抗菌肽等[6-8]。因此提高脊尾白虾先天性免疫能力是目前养殖生产中常用病害防治方法之一。

褐藻寡糖（Alginate oligosaccharides，AOS）是褐藻胶通过褐藻胶裂解酶降解得到的低分子聚合物，是一种无支链阴离子寡糖，由β-D-甘露糖醛酸（M）和α-L-古洛糖醛酸（G）（比例2∶1）构成，其相对分子质量一般低于2×103 [9-11]。褐藻寡糖具有溶解性好、稳定性强、易被吸收、安全无毒和多种生物活性等特点，被广泛应用于生物、医药、食品和农业等方面[12-14]。研究发现褐藻寡糖具有良好的免疫调节活性，适宜的摄入量可以提高水产动物机体免疫能力。在草鱼（Ctenopharyngodon idella）的日粮中添加适量含量的褐藻寡糖可以顯著提高其体内溶菌酶（LZM）、碱性磷酸酶（AKP）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化酶（GSH-Px）的活性，从而提高抗氧化性能增强草鱼的非特异性免疫能力[15-17]。在大菱鲆（Scophthalmus maximus）饲料中添加褐藻寡糖可以显著增加大菱鲆血液中白细胞数量和酸性磷酸酶（ACP）活性，进而提高大菱鲆的非特异性免疫能力[18-20]。在大黄鱼（Larimichthys crocea）和石斑鱼的日粮中添加褐藻寡糖可以显著提高大黄鱼血清中的CAT和LZM活性与石斑鱼血清中CAT、ACP、AKP和LZM的活性，从而提高大黄鱼和石斑鱼的免疫能力[14]。褐藻寡糖投喂刺参（Apostichopus japonicus）可以显著提高其体腔液和体壁中ACP、AKP、LZM和过氧化物酶（POD）活性，从而提高刺参的非特异性免疫能力[21]。

为了探究褐藻寡糖增强脊尾白虾免疫能力的效果及防控“僵尸病”的可行性，本研究给脊尾白虾饲喂不同含量褐藻寡糖的日粮，在相同条件下饲养脊尾白虾60 d后，统计和观察各处理脊尾白虾生长性能、组织超微结构、免疫酶活性、免疫基因表达，并通过二尖梅奇酵母MQ2101攻毒试验检测各处理脊尾白虾对二尖梅奇酵母MQ2101的抗性，以评价日粮中添加褐藻寡糖对脊尾白虾免疫能力的影响。本研究为褐藻寡糖在脊尾白虾免疫调节和防控“僵尸病”方面的应用提供理论基础。

1材料与方法

1.1试验材料

本研究试验用褐藻寡糖来自五洲丰农业科技有限公司；二尖梅奇酵母MQ2101来自本实验室分离保存的菌株；总蛋白质（TP）含量、SOD活性、酚氧化酶（PO）活性、ACP活性、AKP活性以及LZM活性检测试剂盒购自南京建成科技有限公司。

在江苏省海洋水产研究所江苏省脊尾白虾良种场养殖池塘内用地笼收集5 kg种虾，运回养殖车间，于室内水泥池中暂养稳定2 d后，从中挑选规格一致的雌虾[（5.0±0.2） cm]和雄虾[（4.0±0.2） cm]，活力好、无损伤、且性腺发育同步的种虾250尾 （雌雄比3∶1），转移至1 000 L圆形塑料桶中。在温度（25±1） ℃，盐度25±1，溶解氧（7.8±0.5） mg/L，pH 8.1±0.2条件下继续饲养，期间用鲜活沙蚕和四角蛤蜊肉投喂进行营养强化，每天分3次投喂，时间分别为7：00、18：00、21：00，其中后2次的投喂量占投喂总量的80%。每天换水1/3，并及时清理残饵、粪便和死虾等污染物。

挑选受精卵快孵化的抱卵雌虾50尾，转入1 000 L圆形孵化桶中饲养，用灯光引诱的方法收集刚孵化的脊尾白虾幼体，经计数后，随机选取20 000尾刚孵化的幼体转入2个500 L圆形塑料桶中，培养7 d，然后再转入2个1 000 L圆形塑料桶中，继续培育14 d后获得试验用脊尾白虾。脊尾白虾幼体培养条件为温度（26±1） ℃，盐度25±1，溶解氧（7.8±0.5） mg/L，pH 8.1±0.2，饵料主要为刚孵化的丰年虫无节幼体，每天投喂4次。每天换水量为50%，并及时清理残饵、粪便和死虾等污染物。

1.2脊尾白虾褐藻寡糖添加饲料的制备

选取粒径0.8 mm不含褐藻寡糖的南美白对虾配合饲料（南通海大生物科技有限公司产品）作为基础饲料，其主要营养成分为粗蛋白质42.67%、粗脂肪6.15%、钙2.27%、磷1.59%、盐分1.18%、赖氨酸2.45%、蛋氨酸0.71%和苏氨酸1.66%等。将0 g、0.5 g、1.0 g和2.0 g的褐藻寡糖分别充分溶于150 ml超纯水中，然后分别与999.9 g、999.4 g、998.9 g和997.9 g基础饲料充分混合，再用溶解有0.1 g水产专用黏合剂的100 ml水溶液进行充分黏合，制备成0 mg/kg、500 mg/kg、1 000 mg/kg和2 000 mg/kg 4个不同褐藻寡糖添加量的试验用饲料，-20 ℃冷冻保存，使用期限为30 d。

1.3不同含量褐藻寡糖添加饲料的投喂试验

选取规格大小基本一致培育21 d的仔虾，从中随机挑选30尾，再随机分为3组，每组10尾，经吸水纸充分擦干体表水分后，用千分之一的天平称量每组虾的质量，再计算平均每尾虾的初始质量。

从上述挑选的规格一致的虾中随机选取200尾虾，放入500 L圆柱形塑料桶中。试验分为饲料中0 mg/kg褐藻寡糖处理即对照（CK）、500 mg/kg褐藻寡糖处理（T1）、1 000 mg/kg褐藻寡糖处理（T2）和2 000 mg/kg褐藻寡糖处理（T3）4个处理，每个处理设置3桶为3个生物学重复。饲养条件为温度（25±1） ℃，盐度25±1，溶解氧（7.8±0.5） mg/L，pH 8.1±0.2，早6点、晚6点各投喂1次，每天及时调整投喂量，以保证所有虾均处于饱食状态，期间每日换水30%～50%，及时清理残饵、粪便和死虾等污染物，试验周期持续60 d。

1.4生长参数测定

统计各试验桶中存活虾的个数。从各试验桶中随机挑选30尾存活虾，立即放在冰水中麻醉，用吸水纸充分擦干体表水分后，称量每尾虾的质量，计算各试验组平均每尾虾的最终质量。存活率（SR）、特定生长率（SGR）和总质量增长率（TWG）计算公式如下：

SR=Nt/N0×100%

SGR=（lnWt-lnW0）/t×100%

TWG=（TWt-TW0）/ TW0×100%

式中，Nt表示试验结束时试验虾存活数量；N0表示试验开始时试验虾存活数量；Wt表示试验结束时虾的质量；W0表示试验开始时虾的质量；t表示试验持续时间；TWt表示试验结束时虾的总质量；TW0表示试验开始时虾的总质量。

1.5试验样品采集

从各试验桶中随机挑选1尾虾，经冰水麻醉后，取其肝胰腺、肌肉、肠和鳃用2.5%戊二醛（电镜专用）固定后，用于后续透射电镜观察。

从各试验桶中随机挑选5尾活虾，经冰水麻醉后，用酒精棉球擦拭体表，取其肝胰腺和肌肉分别混合，迅速置于液氮中速冻后保存于-80 ℃冰箱用于后续测定相关免疫酶活性。再从各试验桶中随机挑选5尾活虾，经冰水麻醉后，用酒精棉球擦拭体表，取其肝胰腺和肌肉分别混合，迅速置于液氮中速冻后保存于-80 ℃冰箱用于后续测定相关免疫基因表达情况。

1.6透射电镜观察

取经2.5%戊二醛（电镜专用）固定的各试验组脊尾白虾肝胰腺、肌肉、肠和鳃组织样品，磷酸漂洗液漂洗3次，1%锇酸4 ℃固定2 h；ddH2O漂洗3次后，分别用浓度梯度为30%、50%、70%、80%、95%、100%的乙醇溶液脱水2次，每次15 min，在环氧丙烷中过渡，812树脂梯度渗透后包埋，60 ℃聚合，包埋块用Leica UC7型超薄切片机进行半薄定位及超薄切片，醋酸双氧铀和柠檬酸铅双染色切片，用透射电镜观察组织超微结构。

1.7免疫酶活性测定

取肝胰腺和肌肉样品分别称质量，按照1∶9 （g/ml）的比例加入经4 ℃过夜预冷的0.86%生理盐水，高速振荡研磨制备10%组织匀浆液，将制备好的匀浆液于4 ℃、2 000 r/min条件下离心15 min，取上清液置于冰上，先测定总蛋白质（TP）含量，然后用0.86%生理盐水稀释至适宜的浓度后，根据各酶活性检测试剂盒说明书中的方法测定脊尾白虾肝胰腺和肌肉中的SOD、PO、ACP、AKP和LZM活性。

1.8免疫基因表达量测定

使用Trizol试剂盒（美国Invitrogen公司产品），根据说明书中的方法分别提取脊尾白虾肝胰腺和肌肉中的總RNA，用安捷伦2100微量紫外分光光度计（美国Agilent Technologies公司产品）和琼脂糖凝胶电泳（无RNA酶）评估RNA质量。使用Oligo（dT）磁珠富集mRNA，用裂解缓冲液裂解mRNA，随后使用Prime Script RT reagent Kit（中国TaKaRa公司产品）反转录合成cDNA。

以脊尾白虾18S rRNA作为内参，检测8个脊尾白虾免疫相关基因的表达量，引物采用AlleleID软件（v 6.0）设计，所检测基因及引物序列如表1所示。

使用TBGreen Premix Ex Taq TM试剂盒（中国TaKaRa公司产品），按照说明书中的方法进行定量分析，基因相对表达量采用2-△△Ct方法表示。

1.9二尖梅奇酵母MQ2101攻毒试验

从上述各试验桶中随机挑选20尾存活虾分别转入事先准备好的100 L圆形塑料桶中，稳定2 d，稳定条件为温度由（25±1） ℃逐步降至（18±1） ℃并保持，盐度25±1，溶解氧（7.8±0.5） mg/L，pH 8.1±0.2。管理方法同材料与方法1.3中的方法。

攻毒开始前MQ2101先在PDA平板上活化3次，再接种于PDB培养基中，于摇床中28 ℃、150 r/min培养36 h，在4 ℃，3 000 r/min的条件下离心5 min，弃上清，用无菌生理盐水重悬清洗3次，经计数后用无菌生理盐水稀释至1.0×106 CFU/ml，获得菌体使用液。每只虾肌肉注射10 μl MQ2101菌液。注射后正常饲养，并观察各组中虾的状态，及时捞出死虾，统计7 d攻毒存活率。

1.10数据计算与统计分析

试验数据用平均值±标准差表示（n=3），试验数据用Origin 8.1、GraphPad Prism 8和SPSS 24.0软件进行统计分析，检验组间差异，P＜0.05为差异显著。

2结果与分析

2.1生长表现

各处理脊尾白虾生长性能如表2所示，T2处理脊尾白虾终末体質量、总质量增长率、特定生长率均极显著高于CK（P＜0.01）。T3处理脊尾白虾存活率极显著高于CK及其他处理（P＜0.01）。说明饲料中添加1 000 mg/kg褐藻寡糖对脊尾白虾的生长性能具有显著增强效果，而2 000 mg/kg 褐藻寡糖的添加可以显著提高脊尾白虾存活率。

2.2透射电镜观察结果

通过透射电镜观察各处理脊尾白虾不同组织超微结构变化情况，结果如图1所示，各处理脊尾白虾肝胰腺中细胞排列整齐、结构清晰、无明显的空泡和病变；肌肉中肌纤维完整呈弯曲状、无断裂和溶解现象；肠中肠绒毛清晰可见、排列紧密，肠壁中细胞排列整齐、结构清晰、无明显病变；鳃中鳃轴和鳃丝完整、细胞排列整齐，无破裂现象，细胞内各细胞器清晰。说明CK和T1、T2、T3处理脊尾白虾各组织超微结构基本一致，即在本试验添加量下褐藻寡糖对脊尾白虾是安全且无毒副作用的。

2.3免疫酶活性

如图2所示，T2和T3处理脊尾白虾肝胰腺中SOD活性极显著高于CK（P＜0.01），T1处理脊尾白虾肝胰腺中SOD活性显著高于CK（P＜0.05）；T3处理脊尾白虾肌肉中SOD活性极显著高于CK（P＜0.01），T1和T2处理脊尾白虾肌肉中SOD活性显著高于CK（P＜0.05），说明3种添加量的褐藻寡糖对脊尾白虾肝胰腺和肌肉中SOD活性起到增强的效果。如图3所示，T1、T2和T3处理脊尾白虾肝胰腺中ACP活性极显著高于CK（P＜0.01）；T2和T3处理脊尾白虾肌肉中ACP活性极显著高于CK（P＜0.01），T1处理脊尾白虾肌肉中ACP活性显著高于CK（P＜0.05），说明3种添加量的褐藻寡糖对脊尾白虾肝胰腺和肌肉中ACP活性起到增强的效果。图4结果显示，T2处理脊尾白虾肝胰腺中AKP活性显著高于CK（P＜0.05），T1和T3处理脊尾白虾肝胰腺中AKP活性与CK无显著性差异（P>0.05）；T2和T3处理脊尾白虾肌肉中AKP活性极显著高于CK（P＜0.01），T1处理脊尾白虾肌肉中AKP活性显著高于CK（P＜0.05），说明饲料中添加褐藻寡糖对脊尾白虾AKP活性可以起到增强效果，但这种增强效果存在组织间差异性。图5结果显示，T1、T2和T3处理对脊尾白虾LZM活性不具有增强效果。图6结果表示，T2和T3处理脊尾白虾肝胰腺中PO活性极显著高于CK（P＜0.01）；T3处理脊尾白虾肌肉中PO活性极显著高于CK（P＜0.01），说明提高饲料中褐藻寡糖含量可以显著提高脊尾白虾PO的活性。

2.4免疫基因相对表达量

脊尾白虾肝胰腺和肌肉中各免疫基因表达检出结果如表3所示，ALF基因在2种组织中均未表达，SOD、proPO、LZM、CTSB和CTL基因在2种组织中均表达，LGBP、SR仅在肝胰腺中表达，说明这些免疫基因在不同组织中的表达存在差异。

如图7所示，T2处理脊尾白虾肝胰腺中SOD基因的相对表达量极显著高于CK（P＜0.01），T3处理肝胰腺中SOD基因的相对表达量显著高于CK（P＜0.05），说明饲料中添加褐藻寡糖可以提高脊尾白虾的抗氧化能力。图8结果显示，T1和T2处理肝胰腺中proPO基因的相对表达量与CK无显著差异（P>0.05），而T3处理肝胰腺中proPO基因的相对表达量显著高于CK（P＜0.05），说明饲料中添加褐藻寡糖可以提高脊尾白虾proPO基因的表达量，提高其机体免疫能力，但可能存在一定的剂量依赖性。图9、图10和图11结果显示，T1、T2和T3处理脊尾白虾肝胰腺中LZM、SR、CTSB基因以及肌肉中CTSB基因的相对表达量与CK无显著差异（P>0.05），说明饲料中3种含量褐藻寡糖的添加对脊尾白虾中LZM、SR、CTSB这3个免疫基因的表达不具有增强效果。图12结果显示，T1、T2处理肝胰腺中LGBP基因的相对表达量极显著高于CK（P＜0.01），T3处理肝胰腺中LGBP基因的相对表达量显著高于CK（P＜0.05），说明饲料中添加褐藻寡糖可以提高脊尾白虾LGBP基因的表达量，提高其机体免疫能力。图13显示T1处理肝胰腺中CTL基因的相对表达量极显著高于CK（P＜0.01）、T2和T3处理肝胰腺中CTL基因的相对表达量显著高于CK（P＜0.05），肌肉中CTL基因的相对表达量与CK均无显著差异（P>0.05），说明饲料中添加褐藻寡糖可以提高CTL的表达量，但可能存在组织差异性。

2.5二尖梅奇酵母攻毒试验结果

各处理脊尾白虾人工注射二尖梅奇酵母MQ2101后脊尾白虾的存活率如图14所示，试验结果显示，CK的脊尾白虾感染后1 d就开始出现死亡，此时T1、T2和T3处理的脊尾白虾几乎无死亡。各处理的脊尾白虾感染后2 d均出现死亡，且此时脊尾白虾摄食减少、活力减弱。感染3～5 d，T1、T2和T3处理的脊尾白虾存活率均显著高于CK（P＜0.05），且CK在第3 d死亡率达到50%，而T1、T2和T3处理的脊尾白虾在第5 d死亡率才达到50%；第6～7 d各处理的脊尾白虾存活率无显著差异（P>0.05），第7 d CK和各处理存活率均接近10%。说明饲料中添加褐藻寡糖可以短期内提高脊尾白虾对MQ2101的抗性，但不能提高感染后的最终存活率。

3讨论

3.1饲料中添加褐藻寡糖对脊尾白虾生长的影响

饲料中添加适量的褐藻寡糖对水产动物的肠道具有很好的调节作用，有助于其生长性能的提高。Hu等[17]发现饲料中添加褐藻寡糖可以显著提高草鱼的存活率、增质量率和特异生长率。Yang等[16]的研究结果也表明饲料中添加褐藻寡糖可以显著提高草鱼的生长性能，但这种作用存在剂量依赖性。Ashouri等[22]发现饲料中添加褐藻寡糖可以显著提高尖嘴鲈鱼（Lates calcarifer）体内胰蛋白酶、脂肪酶和α-淀粉酶的活性，这说明饲料中添加褐藻寡糖可以提高尖嘴鲈鱼的消化能力，对其生长性能的提高是有意义的。潘金露等[23]研究结果也表明饲料中添加褐藻寡糖可以提高大菱鲆脂肪酶的活性。而霍圃宇等[19]发现饲料中添加褐藻寡糖对大菱鲆幼鱼的生长无显著提高效果。本研究T2处理脊尾白虾的终末质量、总质量增长率和特定生长率极显著高于CK（P＜0.01），说明饲料中添加1 000 mg/kg褐藻寡糖对脊尾白虾生长性能具有显著提高作用；而T3處理脊尾白虾生长性能与CK无显著差异（P>0.05），但存活率极显著高于CK（P＜0.01），说明饲料中添加2 000 mg/kg褐藻寡糖对脊尾白虾的生长可能不具有调节作用，但可以提高虾体对外界环境变化的抵抗力。

3.2饲料中添加褐藻寡糖对脊尾白虾免疫酶活性的影响

病原侵入后会导致机体产生过量的活性氧（Reactive oxygen species，ROS），造成蛋白质等生物大分子损伤，引起生理机能的改变[24]。甲壳动物的抗氧化防御系统酶能够清除机体内过量的活性氧，从而维持机体的稳态[25]。SOD是甲壳动物抗氧化防御系统酶中重要的成员之一，在清除多余的氧自由基与防止细胞损伤方面起着重要作用，是衡量甲壳类动物抗氧化系统状况的重要指标[26]。AKP和ACP都是巨噬细胞溶酶体的重要组成部分，在机体免疫方面起到重要作用，其活力水平常被作为评价甲壳类动物健康水平的重要指标[27]。ACP在酸性条件下能破坏表面带有的磷酸酯异物，并通过修饰外源性病原表面的分子结构，增强机体对其识别效应，促进吞噬细胞发挥作用[28]。AKP能够调节机体钙磷平衡，参与机体免疫应答、角蛋白分泌等生物进程[29]。LZM又称胞壁质酶，是一种碱性酶，能够水解细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1，4糖苷键，致使细胞壁破裂、细菌溶解[30-31]，常被用作甲壳类动物免疫能力检测指标[32]。proPO系统是甲壳类动物体内重要的免疫系统，其主要存在于血细胞的半颗粒及颗粒细胞中[33]，当机体受到病原侵染时，半颗粒细胞能够识别外源性微生物的多糖分子并与之结合来激活系统，将非活化的酚氧化酶原转变为活化的PO，最终形成黑色素参与免疫反应[34-36]。Hu等[17]研究发现饲料中添加褐藻寡糖可以显著提高草鱼体内SOD、POD、GSH-Px和谷胱甘肽还原酶（GR）等抗氧化酶和LZM、AKP等免疫酶活性。Ashouri等[22]研究发现饲料中添加褐藻寡糖可以显著提高尖嘴鲈鱼肝脏中抗氧化水平。Wang等[37]研究发现饲料中添加褐藻寡糖对刺参中LZM、POD和ACP等免疫相关酶活性具有显著增强效果。Yang等[16]研究发现饲料中添加褐藻寡糖可以显著提高草鱼的抗氧化水平。杜以帅[38]研究发现饲料中添加褐藻寡糖可以显著提高刺参体腔液和体壁组织中LZM、ACP、AKP和溶血素的活性。霍圃宇等[19]的研究发现饲料中添加褐藻寡糖可以增强大菱鲆幼鱼体内SOD、ACP和AKP活性。江晓路等[21]研究发现饲料中添加褐藻寡糖可以提高刺参体腔液和体壁中POD、ACP、AKP和LZM的活性，但体壁中的增幅要小于体腔液中的增幅。本研究条件下，饲料中添加褐藻寡糖后脊尾白虾体内SOD的活性较CK显著增强，说明饲料中添加褐藻寡糖能够增强其体内的抗氧化系统的水平，提高其在外界病原入侵时对ROS清除的能力，减少机体可能受到的损伤。相较于CK，T2处理脊尾白虾肝胰腺中SOD活性、肝胰腺和肌肉中ACP活性、肝胰腺和肌肉中AKP活性、肝胰腺中PO活性均极显著提高（P＜0.01）。总的来说，饲料中添加1 000 mg/kg褐藻寡糖对脊尾白虾的抗氧化水平和免疫酶活性提升效果最为显著。

3.3饲料中添加褐藻寡糖对脊尾白虾免疫基因表达的影响

SOD基因编码的蛋白质是抵御ROS诱导损害的第一道防线，同时也是抗氧化防御系统的重要组成部分[39]。在环境胁迫等条件下，SOD将O2-转化为分子氧或歧化H2O2以清除应激诱导的过量ROS，从而保护组织和细胞免受氧化损伤[40]。proPO系统是甲壳动物体液免疫的重要组成部分，主要参与抵御病原体的免疫过程[41]。LZM是一种重要的非特异性免疫因子，通过杀死细菌以防止细菌感染[42]，还能诱导和调节其他免疫因子的合成和分泌[43-44]。LGBP是一种重要的模式识别受体，通过激活先天免疫防御在无脊椎动物中发挥重要作用[45]。LGBP具有促进血淋巴细胞的吞噬、黑化、包囊、凝集等作用，还可以激活proPO级联反应，清除入侵微生物[46]。SR由骨髓细胞（巨噬细胞和树突状细胞）和某些内皮细胞表达，是一种大型的膜结合受体超家族，配体广泛[47]，且能与细菌和凋亡细胞结合并内吞[48]。Qin等[49]利用转录组技术发现凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）被副溶血弧菌感染后，血淋巴中SR的转录水平显著上升，敲除该基因后发现虾体抗菌能力显著降低，表明SR在先天免疫中起重要作用。CTSB是一种蛋白质水解酶，以酶原形式存在于溶酶体中，具有水解多种蛋白质的功能[50]，能够促进细胞凋亡的发生[51-52]。CTL是Ca2+依赖性碳水化合物识别蛋白的一大家族[53]，是甲壳类动物中一种具有识别病原体特殊糖识别结构域的模式受体[54-55]，具有细胞黏附、细菌清除、吞噬和proPO激活等功能[56-57]。Thaimuangphol等[58]对感染嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）的仙虾（Streptocephalus sirindhornae）进行转录组测序发现，感染组的CTL表达量是对照组的3倍，说明其在机体的先天免疫中扮演重要角色。Hu等[17]发现饲料中添加褐藻寡糖可以显著提高草鱼体内白介素-10、白介素-1β、白介素-8和肿瘤坏死因子-α的基因表达水平。Ashouri等[22]发现饲料中添加褐藻寡糖可以提高尖嘴鲈鱼体内c和g型溶菌酶基因的表达水平。本研究中T1处理LGBP基因在脊尾白虾肝胰腺中相对表达量极显著高于CK（P＜0.01），T2处理SOD、LGBP基因在脊尾白虾肝胰腺中相对表达量均极显著高于CK（P＜0.01），各处理LZM、SR和CTSB基因在脊尾白虾肝胰腺中相对表达量与CK均无显著差异（P>0.05）。虽然CTSB基因和CTL基因在脊尾白虾肌肉中可以被检测出，但相对表达量与CK均无显著差异（P>0.05）。总的来说，饲料中添加1 000 mg/kg褐藻寡糖可以提高脊尾白虾体内部分抗氧化和免疫相关基因的表达量，提高脊尾白虾的抗氧化水平和免疫能力，这一结果与上述酶活性结果一致。

3.4飼料中添加褐藻寡糖对脊尾白虾抗二尖梅奇酵母MQ2101能力的影响

Hu等[17]发现饲料中添加褐藻寡糖增强了草鱼的免疫能力，并提高了草鱼对嗜水气单胞菌的抗性。本研究中，二尖梅奇酵母MQ2101攻毒感染后，饲料中添加褐藻寡糖的脊尾白虾存活率在第3～5 d均极显著高于CK（P＜0.01），且各组达到半数死亡率的时间也迟于CK，说明饲料中添加褐藻寡糖对脊尾白虾抵抗二尖梅奇酵母MQ2101的能力具有一定的提高作用，这与上述其对脊尾白虾抗氧化和免疫能力的增强作用一致。感染6～7 d时，饲料中添加褐藻寡糖的脊尾白虾存活率和CK几乎一致，均接近10%，说明随着病原菌在脊尾白虾体内的大量增殖，突破其免疫调节能力范畴后，饲料中添加褐藻寡糖也无法使脊尾白虾长期存活。

综上所述，饲料中添加1 000 mg/kg褐藻寡糖对脊尾白虾的生长性能和免疫能力具有提高效果，且无毒副作用，对二尖梅奇酵母MQ2101具有一定的防控作用。

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（責任编辑：成纾寒）

收稿日期：2023-03-07

基金项目：江苏省农业重大新品种创制项目（PZCZ201747）；江苏省农业科技自主创新基金项目[CX（22）3083]；江苏省种业振兴揭榜挂帅项目[JBGS（2021）122]；江苏现代农业产业技术体系资助项目[JATS（2022）419、JATS（2022）164]

作者简介：史文军（1987-），男，安徽寿县人，博士，副研究员，主要从事海水虾类品种选育和绿色健康养殖研究。（E-mail）muzhiye080326@126.com

通讯作者：万夕和，（E-mail）wxh1708@163.com；秦松，（E-mail）sqin@yic.ac.cn