多杀性巴氏杆菌耐药机制研究进展

车笑吟,闫 满,2,沙万里,2*

(1. 吉林农业科技学院 动物科技学院,吉林 吉林 132109;2.吉林省猪生态养殖及疫病防控科技创新中心,吉林 吉林 132109)

多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida,Pm)是一种条件致病菌,高温、高湿的夏季和秋季以及气候多变的春季使宿主的免疫力降低时,Pm侵入机体在局部大量繁殖引起菌血症和败血症,造成疫病快速流行,发病率高达100%[1],环境中的噪音、光线等外界刺激产生的压力还会导致发病率和致死率上升[2]。哺乳羊羔感染Pm甚至在数分钟至数小时之内死亡[3],一经发生会对养殖业造成巨大损失,而且还会感染人类,严重者可能因此患脑膜炎而致死。该菌引起疾病的途径分为内源性和外源性两种,病畜、病禽的排泄物及分泌物,携带病原菌的动物本身均是该病的重要传染源。但该菌对环境变化的抵抗能力弱,常规消毒剂和去污剂均可将其迅速杀灭[4],对林可霉素、链霉素、磺胺类等抗生素敏感[5]。相关研究表明,Pm的毒力因子包括荚膜、脂多糖(LPS)、菌毛与黏附素、外膜蛋白、铁调节相关蛋白、皮肤坏死因子(PMT)、唾液酸与透明质酸酶、超氧化物歧化酶[6]。

1 Pm的耐药性及耐药机制

研究发现,Pm会对β-内酰胺类、大环内酯类、喹诺酮类、四环素类、氯霉素类、磺胺类抗生素产生较强的耐药性。抗生素的耐药机制是复杂的,持续接触抗生素可以筛选细菌中的耐药菌株[7],从而导致耐药基因可以通过水平基因转移在各种细菌病原体之间共享[8]。

1.1 大环内酯类

大环内酯类抗生素(macrolidesantibiotics,MA)是一类分子结构中具有14～16碳内酯环的抗菌药物的总称,是临床放线菌属细菌的次级代谢产物[9],通过阻断50s核糖体中肽酰转移酶的活性来抑制细菌蛋白质合成。Elsayed等[10]分离的55株Pm对阿奇霉素等大环内酯类药物的耐药率均为50.9%,检测发现其中携带erm频率为40%,34.5%的分离株同时携带mph(E)和msr(E)。erm编码MLSB单甲基转移酶,mph(E)编码大环内酯流出泵,msr(E)编码大环内酯失活磷酸转移酶。Olsen等[11]在与牛呼吸道相关的分离菌株中发现了3个大环内酯类耐药决定因素msr(E)、mph(E)和erm(42),erm(42)基因为靶位甲基化赋予抗性,并在整合结合元件内进行染色体编码。殷贵虎等[12]也曾分离出1株含有大环内酯类耐药基因mef(B)的Pm,提供了Pm耐药和变异机理的进一步研究思路。

1.2 四环素类

四环素类抗生素(Tetracyclines,TCS)是由放线菌产生的一类广谱抗生素,通过与细菌的核糖体结合,进而干扰细菌蛋白质的合成来发挥抗菌的作用[13]。2017年Hu[14]分离的55株Pm对强力霉素的耐药率最高为83.64%;Wentzel等[15]对50株Pm进行检测,发现55.17%的Pm对土霉素耐药;Depenbrock等[16]检测145株Pm,发现所有分离株被归类为对四环素不敏感;王喜等[17]分离出1株含有四环素耐药基因tetB的Pm菌株,该基因编码四环素外排泵,使菌株产生耐药;张亚楠等[18]发现,1株Pm含有5个四环素耐药基因tetA、tetB、tetT、tet34、tet35,其中tetT可能与保护细胞核免受抗生素作用有关;Oh等[19]选择了来自韩国的37株Pm,观察到4种tet基因:tetB(78.4%)、tetH(16.2%)、tetC(5.4%)和tetO(2.7%),这是Pm中tetC的首次报道。

1.3 β-内酰胺类

β-内酰胺类抗生素(β-lactams)能抑制胞壁粘肽合成酶,即青霉素结合蛋白(penicillin binding proteins,PBPs),从而阻碍细胞壁粘肽合成,使细菌胞壁缺损,抑制菌体生长[20]。除此之外,对细菌的致死效应还包括触发细菌的自溶酶活性,缺乏自溶酶的突变株则表现出耐药性。质粒介导的TEM-1和ROB-1β-内酰胺酶基因之前已在Pm分离菌株中发现,使其对β-内酰胺类抗生素产生抗性[21]。Elsayed等[22]在Pm中发现了超广谱β-内酰胺酶基因blaCTX-M和blaCTX-M-1,该基因导致菌株对头孢噻肟具有高度耐药性[23]。

1.4 磺胺类

磺胺类抗生素(Sulfonamides,SAs)是指具有对氨基苯磺酰胺结构的一类药物的总称。磺胺药的化学结构与PABA类似,能与PABA竞争二氢叶酸合成酶,影响二氢叶酸的合成,因而使细菌生长和繁殖受到抑制。磺胺类药物耐药基因sul2通常位于小的非接合性质粒或大的可以转移的多重耐药质粒。Zhu等[24]发现,一株Pm对磺胺甲恶唑的MIC值大于512 mg/L。Niemann等[25]发现,在ΔstrA-dfrA14-ΔstrA片段的上游存在完整磺胺抗性基因sul2。

1.5 氨基糖苷类

氨基苷类抗生素(aminoglycosides)是由二个或三个氨基糖分子和一个非糖部分称苷元的氨基环醇通过醚键连接而成,作用于细菌体内的核糖体,抑制蛋白质的合成,破坏细菌细胞膜的完整性。Schnecker等[26]对分离出的Pm中观察到的最高抗菌药物耐药率(>80%)是壮观霉素。Snyder[27]提到ICE中存在基因aadA25、aadB、strA和strB以及aphA1,这些基因编码氨基糖苷类的抗性基因。aadA25通过编码3'-O腺苷酸转移酶促进对链霉素的耐药性。aadB还编码2'-O腺苷酸转移酶促进对卡那霉素的耐药性。strA、strB和aphA1是编码氨基糖苷类磷酸转移酶的抗性基因,可修饰和灭活氨基糖苷类抗生素。Wang等[28]在研究中检测到的Met、Ser和Phe的丢失被认为会影响突变的S5蛋白与16SrRNA的结合。先前的研究表明,核糖体蛋白S5的19至33位氨基酸形成一个环结构,参与大观霉素与核糖体的结合,导致大观霉素抗性。

1.6 喹诺酮类

喹诺酮类抗生素(quinolones)作用的靶酶为细菌的DNA回旋酶(gyrase)及拓扑异构酶Ⅳ。对大多数革兰阴性细菌而言,DNA回旋酶是喹诺酮类药物的主要靶酶。喹诺酮耐药决定区(QRDR)靶位基因突变通常定位于gyrA或parC的氨基末端结构域,gryB和parE的突变也会导致喹诺酮类药物耐药,但突变频率相对少[29]。张亚楠等[30]在Pm中发现基因mfd,该基因在空肠弯曲杆菌中的过度表达提高了环丙沙星耐药性的自发突变率,对氟喹诺酮类药物耐药性的产生起重要作用。但mfd在Pm中对氟喹诺酮类药物耐药性的作用还需要进一步验证[18]。孔令聪等[31]研究发现,由于突变菌83-位氨基酸由丝氨酸突变为异亮氨酸,环丙沙星与ILE-83的双氢键作用消失,拓扑异构酶C亚基(parC) QRDR的80-位丝氨酸和84-位谷氨酸分别突变为亮氨酸和赖氨酸,使环丙沙星与Ser-80和Glu-84的氢键作用消失,从结构的角度验证了Pm对喹诺酮类药物高度耐药性的原因。

1.7 氯霉素类

氯霉素类抗生素(chloram phenicols)是一种由委内瑞拉链霉菌(Streptomycesvenezuela)中分离提取的广谱抗生素。氯霉素及其氟含衍化物可抑制细菌蛋白质的生物合成。Vassort-Bruneau等[32]研究了25株Pm,在所有这些菌株中都证明了乙酰转移酶(CAT)的产生。PCR扩增结果表明,其中23例产生的CAT为III型。在另外两个菌株中,证明了I型CAT的产生。该基因通过编码CAT从而起到使氯霉素灭活的作用。马雪[33]研究发现,部分Pm含有氯霉素耐药基因floR,该基因编码特异性的外排泵,介导细菌的主要外排作用。

2 其他耐药机制

2.1 整合子介导耐药机制

整合子是一种运动性的 DNA分子,具有独特结构,可捕获和整合外源性基因,使之转变为功能性基因的表达单位。它通过转座子或接合性质粒,使多重耐药基因在细菌中进行水平传播。在革兰阴性菌中已有四类整合子,其中I型整合子检出率最高。sul1基因通常由Ⅰ类整合子介导,是Ⅰ类整合子的一部分。Smith等[34]分离出含有氨基糖苷类耐药基因的Pm占总数的18.1%,它们或来源于整合和共轭元件 (ICE) ICEPmu1或来源于IncQ1质粒,其中包含基因aph(3")-lb、aph(3')-la、aph(6)-ld,赋予对氨基糖苷类药物的抗性。

2.2 SOS反应介导耐药机制

细菌DNA损伤诱导反应(SOS反应)增强了细菌修复损伤DNA的能力,弱化了抗菌药物的影响。张海鹏等[35]研究发现,SOS及同源重组可介导耐药机制,SOS应答与牛荚膜A型Pm对喹诺酮类药物耐药的适应性相关,其中recO基因的缺失可显著降低其对喹诺酮类药物的突变频率。

2.3 抗生素靶位突变介导耐药机制

抗生素靶位突变,即与抗生素结合的DNA或蛋白质靶位点突变或者被修饰后,影响了抗生素与靶点结合,从而影响了抗生素的杀伤作用。Olsen等[11]对大环内酯类高度耐药的Pm进行靶位基因的检测,结果发现3株Pm耐药菌在23SrRNA发生A2059G碱基突变,这一碱基正是克拉霉素结合位点。

3 结论与展望

Pm耐药机制种类繁多,大多数研究证明Pm的耐药性与外排泵介导、药物靶位突变、整合子、耐药质粒等因素有关。本文通过总结前人在Pm与β-内酰胺类、大环内酯类、喹诺酮类、四环素类、氯霉素类、磺胺类抗生素耐药机制方面的研究总结出部分耐药机制。目前,抗生素仍是对巴氏杆菌病的主要治疗手段,但随着抗生素的持续使用,不少巴氏杆菌已经获得了耐药性,并且该耐药性可通过质粒等物质转移到其他菌中,给Pm感染的治疗增加了难度。细菌素是近来备受瞩目的替抗药品,具有良好的抗菌活性和较高的稳定性,部分细菌素被发现对Pm具有抑制作用,但要应用于临床仍需要更多的试验来明晰相关作用机理以及毒副作用。