MMR蛋白、HER2、Ki-67在结直肠癌中的表达及意义*

杨 飞,张亚铭,周潮平,汪大田,高 斌,马 军,汤代彬,袁建伟,王宇翔

(安庆市立医院普外科,安徽安庆 246000)

结直肠癌的发生、发展是一个复杂的过程,染色体不稳定(chromosomal instability,CIN)和微卫星不稳定(microsatellite instability,MSI)是结直肠癌发生、发展的主要分子通路[1-2]。CIN是散发性结直肠癌的主要原因,而MSI被认为是Lynch综合征的遗传诱因,同时其也参与了散发性结直肠癌的发生、发展,具有MSI的结直肠癌约占所有结直肠癌的15%[3]。MSI是错配修复(mismatch repair,MMR)蛋白功能缺陷导致的结果,可以通过PCR检测微卫星位点或免疫组织化学染色检测MMR蛋白(MLH1、PMS2、MSH2和MSH6)的表达来判断,二者检测结果的一致性可以达到95%以上,而免疫组织化学临床简便易行,检测成本低,较为容易开展[4-5]。检测结直肠癌的MMR蛋白的状态对于Lynch综合征的诊断及结直肠癌的治疗有重要作用。人表皮生长因子受体(human epidermal growth factor receptor,HER)2属于ErbB/HER酪氨酸激酶家族,是多种癌症的癌基因和预测生物标志物,也是结直肠癌的潜在治疗靶点[6]。Ki-67是反映细胞增殖状态的特异性指标,与肿瘤细胞增殖活性及肿瘤的发生、发展和转移有关,在各种研究中,Ki-67的表达与结直肠癌患者的相关性目前尚无定论[7-8]。

目前,国内大部分医院对结直肠癌常规行免疫组织化学来了解MMR蛋白表达情况,但大样本量报道较少,且尚无同时检测MMR蛋白、HER2和Ki-67的研究报道。本研究旨在探讨MMR蛋白、HER2和Ki-67在可切除结直肠癌中的表达并揭示其与临床病理特征的关系,为结直肠癌的临床诊疗提供一定的参考依据,现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性分析2017年10月至2022年5月于本院普外科行手术治疗的559例结直肠患者临床资料。纳入标准:(1)术后均经病理证实为结直肠腺癌;(2)临床及病理资料完整;(3)有足够的原发肿瘤组织进行免疫组织化学检测;(4)检测结果包括MMR蛋白、HER2和Ki-67表达情况。排除标准:(1)术前接受新辅助化疗、放疗、免疫治疗或分子靶向治疗等抗肿瘤治疗;(2)诊断时合并其他原发恶性肿瘤;(3)诊断为结直肠癌原位癌、鳞状细胞癌或腺鳞癌。559例患者中男324例,女235例,年龄26～89岁,平均(68.01±10.41)岁,其中直肠癌患者248例,左半结肠癌患者142例,右半结肠癌患者169例。

1.2 方法

1.2.1资料收集

收集患者的临床及病理资料,包括性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤大小、肿瘤大体类型、组织学分型(腺癌、黏液腺癌或印戒细胞癌)、组织学分级、浸润深度、淋巴结转移、远处转移、TNM分期及MMR蛋白、HER2、Ki-67的表达情况,TNM分期依据美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer,AJCC)/国际抗癌联盟(Union for International Cancer Control,UICC)第8版TNM分期系统。

1.2.2结果判断

(1)MMR蛋白表达判读标准:MLH1、MSH2、PMS2、MSH6表达均定位于细胞核,细胞核不着色即为表达缺失,细胞核呈现棕黄色或黄色颗粒则判断为阳性表达。其中MLH1、MSH2、PMS2、MSH6任意蛋白表达缺失判定为表达缺陷(deficient mismatch repair,dMMR),4个蛋白均阳性表达判定为表达完整(proficient mismatch repair,pMMR)。(2)HER2表达判读标准:HER2表达定位于肿瘤细胞膜,根据染色结果评分为0、+、++、+++,其中0为肿瘤细胞无膜染色或<10%肿瘤细胞着色,+为≥10%肿瘤细胞团微弱或隐约可见膜染色,++为≥10%肿瘤细胞团有弱至中等强度的基底侧膜、侧膜染色,+++为≥10%肿瘤细胞基底侧膜、侧膜强染色[9]。因本院病理科前期未开展FISH检测,故本研究收集的病例中HER2++未行FISH检测。(3)Ki-67表达判读标准:Ki-67表达定位于细胞核,呈棕黄色颗粒视为阳性,根据染色结果评分为0、+、++、+++,其中0为阳性细胞数<10%;+为弱阳,即阳性细胞数10%～<25%;++为中等阳性,即阳性细胞数25%～≤75%;+++为强阳性,即阳性细胞数>75%。所有免疫组织化学结果均经两名高年资病理医师共同判读确认。

1.3 统计学处理

采用SPSS26.0软件进行数据分析,计数资料以例数或百分比表示,比较采用χ2检验;采用Spearman等级相关分析相关性,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 结直肠癌患者MMR蛋白表达情况

559例结直肠癌患者中43例(7.7%)为dMMR,见表1。

表1 结直肠癌患者MMR蛋白表达情况

2.2 不同临床病理特征结直肠癌患者的MMR蛋白、HER2和Ki-67表达情况比较

559例结直肠癌患者中HER2 +++为8例(1.4%),Ki-67 +++为251例(44.9%)。不同年龄、肿瘤位置、肿瘤最大径、肿瘤大体类型、组织学分级、淋巴结转移、TNM分期的结直肠癌患者dMMR表达率比较,差异有统计学意义(P<0.05)。不同肿瘤大体类型的结直肠癌患者HER2 ++/+++表达率比较,差异有统计学意义(P<0.05)。不同组织学分型、组织学分级、淋巴结转移、远处转移、TNM分期的结直肠癌患者Ki-67 +++表达率比较,差异有统计学意义(P<0.05),见表2。

表2 不同临床病理特征结直肠癌患者的MMR蛋白、HER2和Ki-67表达情况比较

2.3 MMR蛋白与HER2和Ki-67表达的相关性分析

相关性分析结果显示,MMR蛋白与HER2、Ki-67表达均无相关性(P>0.05),见表3。

表3 MMR蛋白与HER2和Ki-67表达的相关性分析[n(%)]

3 讨 论

结直肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一,基于国家癌症中心最新数据,2016年中国的结直肠癌的发病率位居第2,死亡率位居第4,较前有上升趋势[10]。结直肠癌对人类健康构成了巨大威胁,了解其临床病理特点,可为临床诊断和治疗提供指导。

MMR基因启动子的高甲基化导致散发性结直肠癌,而MMR或EpCAM基因的胚系突变与Lynch综合征相关,通过PCR检测MSI或免疫组织化学检测MMR蛋白表达既可以筛查Lynch综合征,又可以指导结直肠癌患者的药物使用,如5-氟尿嘧啶和程序性死亡受体-1(programmed cell death protein-1,PD-1)抑制剂[11]。若没有分子实验室,诊断结直肠癌合并MSI通常依赖于MMR蛋白的免疫组织化学染色。本研究使用免疫组织化学检测559例结直肠癌MMR蛋白表达,发现dMMR占比为7.7%,与国内几项大样本量研究[4,12]结果相一致,但低于欧洲[13],说明不同地域、种族MMR蛋白表达水平存在差异。本研究显示,不同年龄、肿瘤位置、肿瘤最大径、肿瘤大体类型、组织学分级、淋巴结转移、TNM分期的结直肠癌患者dMMR表达率比较,差异有统计学意义(P<0.05),与文献[3,13]报道基本一致,具有典型的微卫星高度不稳定(microsatellite instability-high,MSI-H)的临床和病理特征。目前,关于MMR状态的性别分布存在争议,LIANG等[14]研究表明dMMR在女性中更常见,而ARORA 等[15]研究则发现男女之间无差异,这与本研究结果一致。

在本研究dMMR患者中,以MLH1、PMS2联合表达缺失(48.8%)最为常见,其次为MSH2、MSH6联合表达缺失(18.6%)和PMS2单独表达缺失(14.0%),这与XU等[3]研究结果一致。在结直肠癌中MLH1缺失是最常见的,多见于散发性病例,而由于PMS2与MLH1形成异源二聚体,因此MLH1的缺失也会导致PMS2的丢失。MLH1和PMS2同时缺失是dMMR结直肠癌最常见的类型,多由锯齿状病变通过锯齿状途径进展为结直肠癌,与MLH1启动子甲基化和BRAF突变相关[16]。MLH1启动子甲基化或胚系突变还可以导致PMS2的单独突变,可以解释本研究中的PMS2的高比例单独表达缺失[17]。约70%的Lynch综合征患者中发现MLH1和MSH2突变,由于MSH2与MSH6形成异源二聚体,因此MSH2的缺失也会导致MSH6的丢失,MSH2和MSH6的同时缺失在Lynch综合征中很常见[18]。对本研究dMMR病例进一步进行胚系突变检测或MLH1启动子甲基化、BRAF突变检测,能识别散发性结直肠癌和Lynch综合征,应特别鼓励这部分患者进行Lynch综合征的遗传咨询和检测。

HER2在乳腺癌和胃癌中都得到了很好的研究和临床应用,但对于HER2表达能否指导结直肠癌治疗及评价预后尚未达成共识,HER2在结直肠癌中的诊断价值也尚未完全标准化。国外大样本量研究发现,HER2参与了结肠癌的发生、发展,但HER2的过表达与患者总生存率和无病生存率无关,HER2的预后价值仍存在争议[19]。而本研究发现,不同肿瘤大体类型的结直肠癌患者HER2 ++/+++表达率比较,差异有统计学意义(P<0.05)。有研究发现,HER2在结直肠癌中的阳性表达率和临床意义存在较大分歧,其报道的HER2阳性表达率为1%～50%,这与样本量大小、标本质量和HER2阳性判断标准有关[20]。虽然本研究免疫组织化学法检测HER2表达严格按照指南界定[9],有8例(1.4%)为+++,但又由于有120例(21.5%)患者为++,对于这部分患者未行FISH检测,势必影响研究结论。对于HER2与结肠直肠癌的生物学特征仍需进一步研究,目前本课题组正在开展结直肠癌患者术前肠镜小标本及手术术后病理标本HER2表达水平的前瞻性研究,以期阐释这一类问题。

本研究结果显示,不同组织学分型、组织学分级、淋巴结转移、远处转移、TNM分期的结直肠癌患者Ki-67 +++表达率比较,差异有统计学意义(P<0.05),与其他研究[21-22]结果一致。有meta分析发现,Ki-67的高表达与结直肠癌患者的不良预后明显相关,其纳入34项研究共6 180例结直肠癌患者,总生存率和无病生存率的合并风险比分别为1.54(P=0.005)、1.43(P=0.008),Ki-67的高表达预示着结直肠患者较差的总生存率和无病生存率[23]。

目前在结直肠癌领域缺乏对于MMR蛋白与HER2、Ki-67的联合表达研究,本研究提示MMR蛋白的表达与HER2、Ki-67的表达在免疫组织化学蛋白表达水平上无相关性,这一结果说明三者在结直肠癌的发病机制中作用机制可能不同,需进一步深入研究。对于晚期结直肠癌,同时检测MMR蛋白和HER2,对于选用免疫治疗或抗HER2靶向治疗有指导意义。QIU等[24]采用二代测序检测HER2基因突变或MSI-H的结直肠癌患者,发现携带HER2突变的MSI-H患者使用PD-1抑制剂的无进展生存期明显短于无HER2突变的患者。最近的一项Ⅱ期临床研究发现,对于HER2阳性的难治性转移性结直肠癌,德曲妥珠单抗(DS-8201研究)显示出强大和持久的抗肿瘤活性,其中包括接受过伊立替康和抗HER2靶向治疗等两种或两种以上方法的患者[25]。在本研究中,dMMR患者未发现HER2 +++,因HER2 ++未行FISH检测,对于MMR蛋白和HER2在结直肠中的表达及意义尚需进一步研究。

综上所述,本研究报道了行手术治疗的结直肠癌患者的dMMR检出率及HER2、Ki-67表达阳性率,比较了三者与结直肠癌临床病理特征的关系,为进一步的临床治疗及研究提供了基础。但本研究也存在局限性:(1)未进行MMR基因分析,故遗传性和散发性病例的确切比例尚不清楚;(2)未对HER2 ++患者行FISH检测,仅从蛋白表达水平上探讨二者相关性,存在一定的局限性;(3)本研究病例是近年来收集的,一些患者的随访时间不够长,无法进行生存分析,需进一步的随访研究。