超高效液相色谱质谱法测定饼干中3 种大麻酚

张闯，赵孔祥，张敏，王利强*

（1.天津海关工业产品安全技术中心，天津 300457；2.天津海关动植物食品检测中心，天津 300457）

大麻中主要成分有大麻酚、大麻二酚、四氢大麻酚3 种。其中大麻酚存在于大麻叶中，是一种脂溶性且不具有精神活性的大麻素，在药用方面可以起到止咳、镇静、安眠等功效，同时大麻酚可以抑制四氢大麻酚引起的不良反应，加强四氢大麻酚的药效，二者搭配使用常作为免疫疾病的主要治疗手段[3-4]。大麻二酚是从大麻植物中提取的纯天然成分，可以起到神经保护、抗炎、代谢与免疫调节等功效[5-6]。在我国大麻二酚属于工业大麻级别，不允许用于食品和化妆品。四氢大麻酚是大麻中主要的精神活性物质，是大麻类毒品中对神经系统起作用的主要成分。我国已将四氢大麻酚列入第一类精神药品管制目录，药理方面可起抗肿瘤、保护心血管和抗菌等作用[7]。因此，开展对饼干中大麻的分析检测工作具有重要意义。

目前大麻酚类物质检测主要有液相色谱[8-9]、气相色谱[10]、气相色谱-质谱[11]、液相色谱-质谱[12-14]、电化学[15]等技术，在食品安全检测领域，质谱技术相较色谱技术存在明显优势[16-18]：灵敏度高，准确性强；抗干扰能力强，目标物质即便在色谱柱上分离效果不好，也可通过化合物的离子化状态进行分析定量。气相色谱质谱法适合易挥发、热稳定、能气化的化合物，同时需要衍生化处理，不适合大麻酚类物质检测[19]，因此，本研究选择液相色谱-质谱法进行大麻酚类物质的测定。

试验运用QuEChERS（quick，easy，cheap，effective，rugged，safe）净化结合超高效液相色谱-串联质谱法，对饼干中大麻酚、大麻二酚和四氢大麻酚的测定进行研究。与之前大麻酚类物质研究相比，本研究首次采用大气压化学电子（atmospheric pressure chemical ionization，APCI）源替代了以往使用较多的电喷雾离子（electrospray ionization，ESI）源，有效降低了基质效应对试验的影响。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Ultra 型超高效液相色谱-串联质谱仪：美国赛默飞世尔科技有限公司；T25 高速分散机：德国IKA 公司；2-15 离心机：美国Sigma 公司。

乙腈、甲醇、乙醇、甲酸（色谱纯）：上海安谱有限公司；试验用水为Milli-Q 高纯水。大麻酚（CAS 号：521-35-7）、大麻二酚（CAS 号：13956-29-1）、四氢大麻酚（CAS 号：192-08-3）：天津阿尔塔科技有限公司；氯化钠、无水硫酸镁、无水硫酸钠、柠檬酸钠、醋酸钠：国药集团上海有限公司；N-丙基乙二胺、C18：天津博纳艾杰尔科技有限公司；石墨化碳黑：上海安谱有限公司；其他所用试剂均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 标准溶液配制

以乙腈配制质量浓度为10 μg/mL 的大麻酚、大麻二酚、四氢大麻酚混合标准溶液，于-18 ℃下储存。以乙腈配制1 μg/mL 的混合标准工作液，配制浓度为2、5、10、20、50、100 ng/mL 的系列混合标准溶液，现配现用。

1.2.2 试剂配制

0.1%甲酸溶液：准确量取1 mL 甲酸于900 mL 水中，水定容至1 000 mL；乙腈-醋酸溶液（99+1）：量取10 mL 醋酸加入990 mL 乙腈中，混匀。

1.2.3 样品前处理

1.2.3.1 样品提取

称取具有代表性的样品5.00 g（精确至0.01 g）于50 mL 离心管中，准确加入乙腈-醋酸溶液（99+1）20 mL，振摇混合均匀，加入6 g 无水硫酸镁、1.5 g 醋酸钠，超声提取10 min，8 000 r/min 离心5 min。

1.2.3.2 样品净化

吸取1 mL 上清液至内含150 mg 无水硫酸镁、100 mg N-丙基乙二胺、50 mg C18 的2 mL 聚丙烯离心管中；涡旋混匀1 min，8 000 r/min 离心5 min，吸取上清液过微孔滤膜，用于测定。

1.2.4 色谱条件

色谱柱：Hypersil Gold C18 色谱柱（柱长50 mm，柱内径2.1 mm，填料粒径1.9 μm）；流动相A：0.1% 甲酸水溶液，流动相B：甲醇，流动相及洗脱条件见表1；柱温：30 ℃；进样量10 μL，流速0.3 mL/min。

表1 流动相及梯度洗脱条件Table 1 Mobile phase and gradient elution conditions

1.2.5 质谱条件

大气压化学电子源（APCI），正离子扫描模式；多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）；离子源温度为300 ℃；放电电流：8.0 μA；雾化气：氮气，310 kPa；离子传输管温度：300 ℃；碰撞气：氩气。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 流动相的选择

本研究选择0.1%甲酸水溶液作为水相溶剂，甲酸可以为阳离子的形成提供必需的质子来源，从而提高目标化合物的离子化效率。有机相对比了甲醇和乙腈两种溶液，试验发现在甲醇作为流动相的情况下，目标化合物的峰形、出峰时间以及响应强度更好。

2.1.2 色谱柱的选择

本研究对比了C18、T3 两种型号色谱柱。目标物在T3 柱下，目标物保留较弱，出峰快，样品中共流出物容易干扰其测定。而在C18 柱下，目标物的峰形及质谱相应强度更好，同时保留时间合适。这是因为大麻酚、大麻二酚、四氢大麻酚都属弱极性物质，C18 柱键合相上的极性基团修饰相较T3 柱更少，C18 柱相较T3 柱对弱极性分子保留能力更好。因此，选择C18 柱作为本试验分析用色谱柱。

2.2 质谱条件的优化

质谱条件的优化在电离源的选择上，本研究对比使用ESI 和APCI 源时目标化合物的出峰情况发现，采用APCI 离子源，目标化合物回收率更好。这可能是因为大麻酚、大麻二酚、四氢大麻酚在溶液中离子化情况较差。ESI 是利用离子蒸发，液相离子化，而APCI 源则是依靠电晕针放电离子化，气相离子化，同时相较ESI，APCI 源更适合弱极性化合物分析，检出限也更低，更适合定量。质谱参数见表2，质谱图见图1。

图1 3 种化合物多反应（MRM）色谱图Fig.1 Chromatograms of three compounds under MRM monitoring

表2 3 种大麻酚多反应监测参数Table 2 MRM parameters for the three cannabinoids

2.3 前处理条件优化

QuEChERS 是近些年较为流行的食品检测前处理方法。其原理类似于固相萃取，利用吸附剂自身特点，吸附基质中的杂质，达到净化的作用。主要步骤包括：样品制备、溶剂提取、盐析剂除水，吸附剂除杂、上清液离心。相较于常用的液液萃取、微波萃取、固相萃取等传统前处理方法，QuEChERS 操作更加便捷、操作时间更短、可应用的基质范围更广、有机溶剂用量更少[20]。

2.3.1 提取溶剂的选择

分别选择甲醇，乙醇、乙腈、乙腈醋酸溶液（99+1）、乙酸乙酯作为提取溶剂，在其他试验条件不变的情况下，对标准添加饼干样品进行提取，不同提取方式的目标化合物回收率见表3。

表3 不同溶剂对3 种大麻酚提取效率的影响Table 3 Effects of different solvents on the extraction efficiency of three cannabinoids

由表3 可知，提取用乙腈醋酸（99+1）溶液提取3 种化合物的回收率最好。因此选择乙腈醋酸（99+1）溶液作为提取溶剂。

2.3.2 超声时间的选择

在其他试验条件不变的情况下，不同超声时间（4、8、10、15 min）下，阳性样品目标化合物回收率变化情况见表4。

表4 不同超声时间对3 种大麻酚提取效率的影响Table 4 Effects of different ultrasound time on the extraction efficiency of three cannabinoids

超声波可以加速饼干在溶液中的溶解，提高反应速率和溶解度。由表4 可知，随着超声时间从4 min延长到8 min 再到10 min，目标化合物的回收率逐渐增大，而在10 min 和15 min 下，目标化合物的回收率基本没有变化，因此选择10 min 作为最终超声时间。

2.3.3 萃取盐包的选择

饼干样品经过乙腈提取后，需要加入萃取盐包分离水相和有机相。选择盐包1（2 g Na2SO4+2 g NaCl）、盐包2（4 g MgSO4+1 g NaCl）、醋酸体系盐包3（6 g MgSO4+1.5 g CH3COONa）、柠檬酸体系盐包（4 g MgSO4+1 g NaCl+1 g C6H5Na3O7+0.5 gC6H6Na2O7）4 种不同盐包组合，通过比较目标化合物的回收率，确定合适的萃取盐包。

其中盐包1、盐包2 属于普通常规盐包，盐包3 属于醋酸缓冲体系，是美国农业部AOAC2007 标准中QUCHERCES 盐包，盐包4 属于柠檬酸缓冲体系，是欧盟EN15662 标准中QUCHERCES 盐包。在其他试验条件相同的情况下，加入这4 种盐包，目标化合物的回收率，见图2。

图2 不同盐包种类对3 种大麻酚提取效率的影响Fig.2 Effect of different types of salt packs on the extraction efficiency of three cannabinoids

由图2 可知，加入醋酸体系盐包3 后，3 种目标化合物回收率都较高，且使用盐包3 提取后的溶液在质谱显示的杂峰较少，因此本试验选择醋酸缓冲体系（6 g MgSO4+1.5 g CH3COONa）作为萃取盐包。

2.3.4 吸附剂的选择

样品经初步净化后需采用无水硫酸镁、石墨化炭黑（graphitized carbon blacks，GCB）、N-丙基乙二胺（primary secondary amine ，PSA）、C18 等吸附剂对基质中的杂质进行进一步净化。其中，MgSO4可除去提取液中少量水分；GCB 可以通过自身结构吸附干扰物质；PSA 通过胺基的弱离子交换作用和极性基质成分形成氢键，可有效去除色素、糖类、有机酸等；C18 主要依靠非极性相互作用吸附脂肪等物质。

本试验选用6 种不同配比的吸附剂组合，分别为吸附剂组合1（0.1 g MgSO4+0.1 g PSA+0.1 g C18）、吸附剂组合2（0.15 g MgSO4+0.1 g PSA+0.05 g C18）、吸附剂组合3（0.15 g MgSO4+0.2 g PSA+0.1 g C18）、吸附剂组合4（0.2 g MgSO4+0.15 g PSA+0.15 g C18）；吸附剂组合5（0.2 g MgSO4+0.2 g PSA+0.1 g C18+0.1 g GCB）；吸附剂组合6（0.15 g MgSO4+0.1 g PSA+0.15 g C18+0.2 g GCB）。在其他试验条件相同的情况下，分别向阴性基质中添加20 ng/mL 混合标准溶液，通过比较大麻酚、大麻二酚、四氢大麻酚的回收率来确定最佳吸附剂组合，结果见图3。

图3 不同吸附剂组成对3 种大麻酚提取效率的影响Fig.3 Effect of different adsorbent combinations on the extraction efficiency of three cannabinoids

由图3 可知，吸附剂组合2 在饼干基质中均呈现出最佳的净化效果，3 种物质的回收率为82.1%～85.4%。因此本试验选择吸附剂组合2（0.15 g MgSO4+0.1 g PSA+0.05 g C18）作为吸附剂。同时也看到加入GCB 降低了3 种目标化合物的回收率，这是因为GCB是6 个碳原子构成的平面六角形，对平面苯环结构的化合物有较强的吸附作用，大麻酚、大麻二酚和四氢大麻酚三者均有平面苯环结构。吸附剂中加入GCB 会吸附溶液中的大麻酚类物质，降低回收率。

2.4 基质效应评价

在液相色谱质谱检测中，基质效应普遍存在，影响定量结果的准确性，APCI 替换ESI 在一定程度上可以消除基质效应，提高定量准确度。基质效应（matrix effect，ME）计算方法为ME=A/B-1，式中，A 为基质标准曲线斜率；B 为溶剂标准曲线斜率。当ME＞0，表明基质效应增强；ME＜0，表明基质效应抑制；|ME|=0 表示不存在基质效应；|ME|＜0.2 为弱基质效应；0.2≤|ME|≤0.5为中等基质效应；|ME|＞0.5 为强基质效应。不同电离模式下的基质效应如表5 所示。

表5 不同电离模式下的基质效应Table 5 Matrix effects under different ionization modes

由表5 可知，使用ESI 源检测3 种大麻酚，三者均呈现中等基质效应，但在APCI 下三者呈弱基质效应。APCI 的使用大大降低了3 种化合物的基质效应。在相关研究中认为在利用液相色谱串联质谱进行检测分析时，ESI 源比APCI 源更容易出现基质效应[21]。

2.5 方法学验证

2.5.1 线性方程与检出限、定量限

以3 倍信噪比确定方法检出限，以10 倍信噪比确定定量限，大麻酚、大麻二酚、四氢大麻酚的线性关系及检测灵敏度如表6 所示。

表6 大麻酚、大麻二酚、四氢大麻酚的线性关系及检测灵敏度Table 6 Linear relationship and detection sensitivity of cannabinol，cannabidiol，and tetrahydrocannabinol

2.5.2 回收率与相对标准偏差

取空白样品，选择低5 ng/mL、中20 ng/mL、高100 ng/mL 3 个浓度进行添加回收试验，重复6 次，回收率及相对标准偏差如表7 所示。

表7 方法回收率和相对标准偏差（n=6）Table 7 Method recovery rate and relative standard deviation（n=6）

由表6、表7 可知，该方法的精密度和准确性良好。

2.6 实际样品测试

从市场上采集了8 份饼干样品，经测定均未检出大麻酚、大麻二酚和四氢大麻酚。

3 结论

本研究采用液相色谱串联质谱技术对饼干中大麻酚、大麻二酚、四氢大麻酚进行了痕量检测。研究首次采用APCI 源替代ESI 源，大大降低了基质效应。通过优化提取溶剂、超声时间、萃取盐包组成、吸附剂用量搭配等QuEChERS 前处理条件规避了传统液相色谱法检出限高、样品处理复杂等问题。该方法简便快速，结果准确性高，适合于饼干中大麻酚、大麻二酚、四氢大麻酚的测定。