基于网络药理学探索延胡索治疗血栓的潜在作用机制

黎毅 李浩玲 周浓 祁俊生 蒋雪梅 戚文华

摘 要：为探索延胡索治疗血栓的潜在作用机制，检索中药系统药理学数据库（TCMSP），对延胡索药效成分进行筛选，利用PubChem数据库获得药效成分3D结构，并通过Pharmmapper数据库筛选出各活性成分可能存在的靶点；通过CTD数据库挖掘与血栓相关的作用靶点，利用STRING获得与血栓相关的作用靶点的蛋白相互作用网络，通过GO功能富集和KEGG通路分析延胡索干预血栓的分子机制。结果表明：从延胡索中共筛选出13个主要成分，预测出延胡索与血栓相关靶点238个，选出26个关键靶点。GO富集分析结果主要涉及各种功能蛋白的活性、调控等过程。KEGG通路富集得到4条通路，包括蛋白聚糖在癌症中的应用、前列腺癌、膀胱癌以及丁酸代谢通路。综上所述，延胡索发挥抗血栓作用可能通过多成分、多靶点起作用，为延胡索药材质量标准的制订和提升提供了参考。

关键词：延胡索；血栓；作用机制；信号通路

中图分类号：R93 文献标志码：A文章编号：1673-5072（2024）02-0142-08

随着人们生活水平的提高及人口老龄化情况加剧，心血管疾病的发病率逐年升高，根据《中国心血管病报告2021》，2019年我国农村和城市心血管病均占死因的40%以上［1］。血栓是引发心血管疾病的重要原因之一，引发血栓的菲尔绍（Virchow）三要素有：静脉血液瘀滞、静脉系统内皮损伤和血液高凝状态。血栓性疾病目前严重威胁人类的生命健康，其发病率高，老年人更易患病。近年来，中药及其制剂逐渐应用于血栓性疾病，已有研究表明，丹参具有抗血小板聚集作用，其多种制剂可用于脑梗死、冠心病及心绞痛等心脑血管疾病［2］；红花注射液对小鼠脑梗塞、大鼠“血瘀”症状有明显治疗作用［3］。李冰［4］通过建立大鼠体内的血栓模型发现，延胡索提取物可降低大鼠的全血比粘度，提高血液流变性，对大鼠的动-静脉旁路所诱发形成的血栓有抑制作用；此外，延胡索对电刺激动脉形成的血栓有抑制作用［5］。

延胡索（Corydalis yanhusuo）为罂粟科（Papaveraceae）紫堇属（Corydalis）植物，别名玄胡素、元胡、延胡、玄胡索、元胡索，其味辛苦，性温，含多种异喹啉类生物碱，具有活血、行气、止痛的功效。它是一味中医常用的中药药材，沿用千年至今［6］，主要用于气血瘀积所致的各种疼痛。近年来，延胡索已用于治疗心力衰竭、冠心病、痛经等疾病，疗效好、副作用小。李彩虹［7］利用人参延胡索汤对冠心病心绞痛患者进行对照治疗，对照组给予西医常规治疗，治疗组在对照组治疗基础上给予自拟中药人参延胡索汤治疗，对比结果表明，治疗组总有效率明显高于对照组。延胡索是临床治疗血栓性疾病的常用药物之一，但其作用机制仍有待探究。

网络药理学通过对数据库检索分析，采用复杂网络模型，从系统水平解释药物与机体靶点相互作用关系，其复杂性符合中药多成分、多靶点的特点，是中医药现代研究的新热点。本研究通过网络药理学方法初步研究延胡索干预血栓的主要活性成分和可能的靶点，探寻其作用的分子机制，对延胡索临床应用提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 延胡索药物活性成分的筛选

目前用于查询中药成分的数据库较多，其中疾病-靶标网络的药理学平台——中药系统药理数据库TCMSP（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）是一个较为理想的综合中药平台［8］，其中包含了499味中药以及对应的超2.9万个化学成分，数据丰富，可信度高。本研究通过TCMSP数据库搜索草药名“yanhusuo（延胡索）”，收集延胡索的药效活性成分，根据成分的药动学（吸收、分布、代谢、排泄（ADME））进一步筛选［9］，筛选条件为：口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%、药物相似性（Drug-likeness，DL）≥0.18和生物半衰期（Biological Half Life，HL）≥4，以获取延胡索的主要药效活性成分，通过PubChem Database（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）等化学成分数据库检索筛选延胡索化学成分的分子3D结构，以sdf格式保存，以此构建延胡索药效成分的化合物结构数据库。

1.2 应用软件准备

Strawberry-perl-5.30.0.1-64bit，JAVA8.0，Cytoscape_v3.7.1，R×64 3.6.1，安装路径为C盘，不得出现中文和空格。

1.3 延胡索药效成分靶点预测与疾病靶点查询

利用Pharmmapper Server（http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/submitfile.html）数据库，根据化合物的3D结构预测延胡索潜在的化合物药效靶点基因信息。使用CTD（http：//ctdbase.org/ about/）数据库，以“Thrombosis”为关键词进行查询，获得血栓性疾病过程中已知的靶蛋白。

1.4 延胡索干预血栓性疾病潜在作用靶点蛋白质相互作用网络构建与分析

通过韦恩图将延胡索的药效成分靶点同血栓性疾病靶点取交集，获得延胡索与血栓性疾病相关的化合物靶点并将其导入String（http：//string-db.org）数据库，获取蛋白质相互作用（PPI）网络，下载并保存为tsv格式，以此构建延胡索潜在药效作用靶点的蛋白相互作用网络图。

1.5 延胡索干预血栓性疾病成分-靶点的网络构建

将筛选出的延胡索化合物信息以及靶点PPI网络对应关系导入Cytoscape，构建延胡索治疗血栓性疾病的成分-靶点网络。对其風格（style）、节点（nodes）、线条（edges）等进行设置，构建延胡索干预血栓性疾病的成分-靶点网络关系图，并进行可视化分析。

1.6 GO和KEGG分析

为研究药效团可能作用的生物学通路，探寻靶点间相互作用及基因功能的富集情况，对药效团的各个靶点基因进行GO（Gene Ontology）功能富集分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of genes and genomes）生物学通路注释分析。使用R3.6.1，载入相应的程序包，设置气泡图和柱状图的高、宽、显示目录以及P值等参数，获得GO和KEGG可视化结果。

2 结果与分析

2.1 延胡索活性成分及相应靶蛋白的筛选

利用TCMSP检索获得延胡索药效成分77个，符合筛选条件的主要药效成分有26个，其中13个药效成分的药物相似性较高，在0.8以上（表1），说明这些成分药动学性质较好，安全性较高，选取这些药效成分进行药物靶点预测。

2.2 药物靶点预测

对延胡索筛选出的13个药效成分在Pharmmapper数据库中进行靶点预测并进行基因名称的注释，获得了849个与人类有关的药效靶点基因，去除重复项，剩余241个靶点。查询CTD数据库，获得血栓相关靶点29 046个，通过Venny图与药效化合物靶点取交集，得到延胡索中与血栓相关的靶点有238个，占延胡索化合物靶点的98.76%，占血栓靶点的0.82%，延胡索化合物靶点中不参与血栓的延胡索化合物靶点仅有3个，占延胡索化合物靶点的1.43%，即RBM41、GSTT2B、ADRBK1（图1）。

2.3 延胡索干预血栓靶点的蛋白质相互作用网络构建

利用String数据库筛选获得238个靶点的PPI网络，该相互作用网络图包含139个表示靶蛋白的节点和269条表示靶点间相互作用关系的线，各靶点间相互作用网络较复杂（图2）。进一步分析发现，延胡索干预血栓靶点的节点度大于均值（3.87），且介数中心性大于均值（0.038）的关键靶蛋白有26个，分别为RAC1、POLR2H、POLR2F、CCNA2、PCNA、CUL1、APP、B2M、NCBP1、CCND1、ESR1、CPSF3、DDB1、NOTCH1、HSP90AB1、HDAC7、HDAC6、ERBB2、NUP214、CAT、RAN、DLAT、HSD17B4、NAE1、EPHB2、AR。其中，靶蛋白RAC1的节点度和介数中心性均最大，表明RAC1可能在整个蛋白质网络中作用很大。

2.4 成分-靶点网络构建

成分-靶点网络分析结果显示（图3）：该网络共有150个表示化合物和靶点的节点，735条表示靶点之间以及靶点与化合物之间相互作用的线，473个药效团与靶点之间的关系，262个靶点之间的相互作用关系。化合物与筛选出的靶点的联系越密集，说明该化合物干预血栓的可能性越大。在该网络图中，排名前七位的化合物是紫堇醇灵碱（18797-79-0，节点度=40）、荷包牡丹碱（bicuculline，节点度=40）、二氢白屈菜红碱（dihydrochelerythrine，节点度=40）、刺罂粟碱（stylopine，节点度=39）、黄连碱（coptisine，节点度=38）、伪原阿片碱（24240-05-9，节点度=37）、岩黄连碱（dehydrocavidine，节点度=37），说明这些药效成分可能是延胡索起到治疗血栓作用最关键的成分。

2.5 延胡索干预血栓靶点GO功能富集分析

将筛选出的延胡索可能干预血栓的238个靶点进行GO功能富集分析，得到共43个GO条目，排在前20位的GO可视化分析结果显示（图4）：延胡索治疗血栓性疾病的生物学过程、分子功能较多，其中，热休克蛋白Hsp90结合（Hsp90 protein binding），P值最小，是最为明显的生物过程，该过程涉及8个作用靶标，分别为RPS3、UNC45A、USP19、CYP2E1、GBP1、HDAC6、HDAC8、KDR，这可能是延胡索治疗血栓性疾病最重要的生物过程。此外，其他生物过程还包括类固醇激素受体活性（steroid hormone receptor activity）、受损DNA结合（damaged DNA binding）、细胞核受体活性（nuclear receptor activity）、转录因子活性（transcription factor activity）、细胞粘附分子结合（cell adhesion molecule binding）、酪氨酸蛋白激酶活性（protein tyrosine kinase activity）等，也是延胡索治疗血栓性疾病可能较重要的生物过程，应该重视这些过程对血栓的影响。

2.6 延胡索干预血栓性疾病靶点KEGG通路富集分析

将238个靶点进行KEGG通路富集分析，预测出延胡索干预血栓的靶点通路较少，富集到4个KEGG通路（图5），分别是蛋白聚糖在癌癥中的应用（Proteoglycans in cancer）、前列腺癌（Prostate cancer）、膀胱癌（Bladder cancer）以及丁酸代谢（Butanoate metabolism）通路，KEGG通路富集分析结果显示，蛋白聚糖在癌症中的应用是最明显的通路，涉及15个作用靶标，分别是IGF1R、VAV3、PPP1CB、ARHGEF12、ESR1、FLNB、ARHGEF1、ERBB2、CCND1、MMP2、RAC1、MDM2、THBS1、MSN、KDR，这可能是延胡索治疗血栓最重要的作用通路。蛋白聚糖在癌症中的应用和前列腺癌通路富集图如图6、图7所示。从图6可看出，蛋白聚糖在癌症中的应用通路可能涉及的靶点还有RAC1、cyclinD1、MP以及LARG等，与该通路联系紧密的通路还有MAPK信号通路、钙离子信号通路等。由图7可见，前列腺癌通路涉及的靶点有GFR、AR、HSP、MDM2、CDK2以及CyclinD1等，与该通路联系紧密的通路还有PI3K-Akt信号通路、p53信号通路等。因此，延胡索可能在前列腺癌及膀胱癌等癌症通路中对血栓治疗发挥作用。

3 讨 论

3.1 延胡索干预血栓的主要靶点及药效成分

本研究通过TCMSP筛选得到延胡索的13个主要活性成分，获得延胡索干预血栓的238个靶点，735个可能存在的相互作用关系，说明延胡索在治疗血栓性疾病上有一定生化联系。延胡索的关键作用靶点主要有RAC1、POLR2H、POLR2F、CCNA2、PCNA、CUL1、APP、B2M、NCBP1、CCND1等，这些靶点在网络中起的作用较大。其中CCNA2基因可以使心肌梗塞的猪心心脏组织再生，以及在心肌梗塞区域的周围有出现新心肌细胞的迹象以及心脏泵血功能的显著改善［10］。APP（急性期蛋白）在创伤、感染等引起应激时，有抑制多种水解酶的作用，在炎症区域具有凝血和溶纤作用，延胡索通过对APP作用，可能对干预血栓形成有一定帮助。延胡索化合物-靶点网络构建结果显示，延胡索起到治疗血栓性疾病作用最可能的成分包括紫堇醇灵碱、荷包牡丹碱、二氢白屈菜红碱、刺罂粟碱、黄连碱、伪原阿片碱、岩黄连碱，这些成分对治疗血栓性疾病的疗效可能较大。其中紫堇醇灵碱可缓解高血压心力衰竭［11］；荷包牡丹碱对抑制人肝癌MHCC97-H细胞的转移及侵袭有显著作用［12］，汪波［13］利用小鼠实验发现荷包牡丹碱对小鼠有较好的抗心律失常活性。此外，刺罂粟碱存在抗炎活性，Velayutham等［14］发现刺罂粟碱具有调节血管内皮生长因子受体（VEGFR-2）的潜力，并能抑制骨肉瘤细胞；Jang等［15］研究表明，刺罂粟碱通过抑制一氧化氮合酶（iNOS）和环氧合酶-2（COX-2）表达来抑制巨噬细胞中的一氧化氮和前列腺素E2（PGE2）产生。

3.2 延胡索干预血栓靶点功能分析

GO结果显示，延胡索治疗血栓性疾病靶点的功能主要体现在热休克蛋白Hsp90的结合、类固醇激素受体活性、受损DNA结合、细胞核受体活性、转录因子活性等，这些功能主要涉及有关基因的转录、翻译以及有关蛋白的活性，其中热休克蛋白Hsp90的结合是最为明显的生物过程，涉及8个作用靶标。KEGG结果则涉及蛋白聚糖在癌症中的应用、前列腺癌等4个通路。有研究表明，肿瘤可导致血液的高凝，引发血栓，所以延胡索可能不仅对于治疗癌症有一定功效，在治疗血栓方面也可能有作用。在蛋白聚糖在癌症中的应用通路中，通路下游的多个蛋白如RAC1、CyclinD1、MP、LARG等可能直接或间接作用于细胞的增殖和存活，促进血管内皮细胞的增生和在内皮化，从而促进有血栓的血管愈合，这对于延胡索治疗血栓性疾病提供了依据。此外，下游RTKs（受体酪氨酸激酶）可以间接性地抑制肿瘤血管生成，Moesin（膜突蛋白）可间接作用于肿瘤细胞转移和侵袭。肿瘤形成是引发血栓的重要原因之一，有研究表明，血栓常作为隐性癌的临床表现［16］，因此延胡索可能通过抑制癌症的通路中的相关基因或靶点治疗血栓性疾病。在前列腺癌通路中，GFR（表皮生长因子）作为其下游分子，可介导PI3K-Akt信号通路和MAPK通路。PI3K-Akt信号通路主要与细胞生长和凋亡密切相关［17］，参与血小板的粘附聚集等过程，使纤维蛋白发生聚集［18］。PI3K-Akt信号通路可通过减少mPTP释放，在线粒体水平上发挥心肌保护作用，从而达到治疗心力衰竭的作用［19］，为治疗血栓性疾病提供了思路。由图6可知，MDM2基因可间接地抑制细胞凋亡，此外，杨娟［20］通过大鼠电刺激模型实验发现延胡索乙素可有效减少动脉血栓形成、增加动脉血流量，同时对其抗血栓机制深入研究，发现其作用机制与拮抗损伤后的血管内皮细胞凋亡和抑制组织因子表达有关，所以蛋白聚糖在癌症中的应用通路对治疗血栓性疾病可能有一定疗效。

3.3 延胡索在治疗血栓性疾病中的常见案例

在现代各种疾病中，常见的临床血栓性疾病多种多样，如动脉粥样硬化、脑血栓形成、冠心病、心绞痛、心肌梗死、血栓性闭塞性脉管炎、风湿性心脏病、心力衰竭以及心律失常等。血栓形成有三个关键因素为炎症反应、血管生成和纤维蛋白聚集。延胡索主要成分为生物碱、甾体、有机酸和糖类［21］。有研究表明，延胡索有增加血液流通，缓解大鼠心力衰竭的功效［22］，陈岑［23］通过实验发现延胡索具有显著的抗血小板聚集作用。此外，临床上延胡索对冠心病有较高的疗效［24］。何四琴［25］发现，在缺血性心律失常患者中应用复方延胡索汤剂与美托洛尔联合治疗疗效显著，可加速患者心率变异性指标及临床症状改善，增强心肌功能，且不会导致不良心脏事件，安全性高。由此可见，延胡索在治疗血栓性疾病（如冠心病、心绞痛等）方面有重要作用。

4 结束语

以上研究分析可知，延胡索药物介导血栓性疾病的治疗机制具有复杂性、多样性，不能从单一角度进行研究，通过对其复杂网络的分析，可从中找出多个干预血栓性疾病的靶点、功能和通路，在此基础上可探索多样化的治疗方法。在中医治疗血栓疾病過程中，医生常常运用复方制剂以及多种药物联合用药以增强用药效果，本研究仅对延胡索这一种药物内的多种药效成分进行研究，发现其对血栓性疾病的作用机制主要是通过介导炎症反应、抑制细胞凋亡、介导免疫途径及抑制癌症等方式发挥疗效。本研究主要预测了延胡索抗血栓的可能机制，仅为后续药物复方制剂的配伍机制研究提供参考，但药物在体内可能还受到机体自身以及其他因素影响，因此后期还需进行体外实验对本研究的预测结果进行验证。

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Potential Action Mechanism of Corydalis yanhusuoin the Treatment of Thrombus Based on Network Pharmacology

Abstract：The pharmacodynamic components of Corydalis yanhusuo are screened by searching the TCM Systematic Pharmacology Database（TCMSP） in order to explore the potential action mechanism of C.yanhusuo in the treatment of thrombus.PubChem database is employed to obtain the 3D structure of pharmacodynamic components and Pharmmapper database is utilized to screen out the potential targets of each active component.The target associated with thrombus is mined through CTD database and the protein interaction network （PPI） of the target associated with thrombus is obtained by STRING.The molecular mechanism of C.yanhusuo in intervention of thrombus is analyzed by GO functional enrichment and KEGG pathway.The results show that a total of 13 main components are screened from C.yanhusuo and 238 targets related to thrombus are predicted，including 26 key targets screened.The results of GO enrichment analysis have mainly involved the activity and regulation of various functional proteins.KEGG pathway is enriched to obtain 4 pathways，including the application of proteoglycans in cancer，prostate cancer，bladder cancer and butanoate metabolic pathways.In conclusion，the antithrombotic effect of C.yanhusuo may be achieved through multi-components and multi-targets，providing references for the formulation and improvement of the quality standard of C.yanhusuo.

Keywords：Corydalis yanhusuo；thrombus；action mechanism；signaling pathway