4个北美冬青品种对干旱胁迫的应激反应及耐旱性比较1)

李雪霞 钟颂正 陈茜 狄晶晶 陈颖

(南方现代林业协同创新中心(南京林业大学),南京,210037)

落叶型冬青(IlexverticillataL.)又名轮生冬青、北美冬青,是冬青科(Aquifoliaceae)冬青属(Ilex)多年生落叶灌木,引自欧洲和北美洲[1],其冬季落叶,果实红色,挂果时间长,具有较高的观赏价值和商业价值,在园林绿化、切枝观赏市场上占有重要地位[2-3]。近十几年来,在我国东部沿海地区开展了北美冬青的种质资源引进和新品种推广,相关研究也逐渐开展,如在组织培养[4-5]、抗逆性[3,6-7]、基因组大小[8]、整形修剪[9]、果实呈色及生长发育[10-11]等方面都有了一些进展。由于北美冬青来自国外,引种到国内后,其品种适应性会有差异,在各地区的生长也不同,若向西北部地区推广就会遇到干旱缺水的问题,即使在雨量比较充沛的地区,也会遇到季节性干旱问题。因此,研究北美冬青的耐旱性机制可为其抗旱新品种的筛选、推广及应用提供技术参考,具有重要的现实意义和必要性。

干旱是植物生长和分布的主要限制因子之一[12-13]。干旱胁迫会导致气孔关闭,光合降低,进而导致渗透胁迫,膜脂过氧化,最终会导致核酸蛋白质的降解[14-16]。植物主要通过形态结构、生理代谢、提高抗氧化酶活性、基因表达等共同作用体现对干旱环境的适应性[14],这方面的研究在农作物和林木较多,但对北美冬青的耐旱性及其耐旱性机制的研究颇少。

本研究选择4个北美冬青新品种(分别为IlexverticillataL.‘Red Sprite’、IlexverticillataL.‘Gray’、IlexverticillataL.‘Oosterwijk’、IlexverticillataL.‘Winter Gold’)的两年生扦插苗为试验材料,研究不同干旱胁迫强度对其生长的影响及抗氧化应激机制,并通过综合分析评定各品种的耐旱能力,从而筛选出抗逆性较好的品种,为北美冬青新品种的推广、繁育及适应性提供理论依据和技术参考。

1 材料与方法

试验材料:供试材料为4个北美冬青(IlexverticillataL.)2年生扦插苗,品种分别为‘Red Sprite’(Rp)、‘Gray’(Gr)、‘Oosterwijk’(Os)、‘Winter Gold’(Gd),其中Rp引自美国,其他品种来自南京青珠果园艺有限公司。将苗木移植到花盆中,苗木培育及管理方法见文献[3]。人工气候室温度控制在(25±2)℃,光合有效辐射为160 μmol·m-2·s-1,光照时间为每天14 h。

处理方法:采用自然控水干旱处理方法,使土壤含水量逐渐降低,达到水分胁迫梯度的要求[15]。经预试验发现,在自然失水0、6、12 d后,可以得到3个水分梯度:对照组(正常供水,土壤含水量在58%～64%),轻度干旱组(自然失水6 d,土壤含水量在40%～51%),重度干旱组(自然失水12 d,土壤含水量在31%～37%)。每处理6株植株,3次重复,每处理共18株。选取长势一致、健壮、无病虫害植株进行处理。试验前对盆栽苗木充分浇水,使土壤含水量达到饱和状态,然后通过持续控水的方法,逐渐降低土壤含水量达到水分胁迫梯度,并分别在各时段取样。选取枝条顶端从上往下第3～6片叶为材料,其中一部分叶片立即用于含水量、叶绿素和电导率的测定,剩余的叶片在超低温冰箱中-80 ℃保存,用于各项生理生化指标的测定。

数据处理:试验设置3次重复,采用Microsoft Excel 2016对数据进行处理,采用SPSS 21.0软件对处理间的差异显著性进行分析(Duncan新复极法,P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 干旱胁迫对北美型冬青叶片形态、含水量及叶绿素质量分数的影响

经干旱处理12 d(严重干旱)时,4个冬青品种的叶片表型对干旱的反应不同,从图1可见,Gr和Rp品种叶片没有出现干枯现象。Gr品种叶片颜色呈现黄绿色,叶片较厚;Rp品种叶色为深绿色,叶片较硬、较厚;Os品种的叶缘出现了稍许干枯,叶片较薄;而Gd品种的叶缘大部分出现了干枯,叶色深绿,为最不耐旱品种。

图1 4个北美冬青品种干旱处理时叶片的表现

由表1可见,4个北美冬青品种的叶片含水量均随着干旱胁迫时间的增加而呈下降趋势。在处理6 d(轻度干旱)时,各品种的叶片含水量下降幅度较小,含水量均在62.20%～70.80%之间;而干旱胁迫12 d(严重干旱)时,Rp的叶片含水量较对照只下降了9.5%,Gr、Os、Gd的叶片含水量下降幅度较大,分别比对照下降了43.4%、43.0%、25.9%,各处理均与对照存在显著差异(P<0.05)。

表1 干旱胁迫时4个北美冬青品种的含水量和叶绿素质量分数

4个北美冬青品种的叶绿素质量分数也随着干旱胁迫时间的延长呈下降趋势。在干旱处理6 d时,Gr的叶绿素质量分数下降幅度最大(43.2%),与对照存在显著差异(P<0.05);在干旱12 d时,Rp、Gr、Os、Gd 4个品种的叶绿素质量分数与对照相比下降幅度明显,分别下降了44.0%、58.3%、44.7%、36.9%,其中降低幅度最小的品种为Gd(表1)。

各品种的叶绿素a、b质量分数比均随着干旱胁迫时间的增加呈增加趋势,在干旱12 d时,Rp、Gr、Os、Gd 4个品种的叶绿素a、b质量分数比分别比对照提高了102.5%、67.8%、48.6%、41.0%,Rp、Gr品种提高幅度较大,说明干旱胁迫对叶绿素b影响更大,叶绿素a在光合作用中占主导力量。

从类胡萝卜素质量分数变化可见,Rp、Os在轻度干旱时变化不显著,只有Gr出现了下降。但在严重干旱(12 d)情况时,Rp、Gr、Os 3个品种的类胡萝卜素质量分数都出现了显著降低,分别比对照(正常浇水)降低了16.0%、42.9%、28.0%,Gd品种也降低了21.3%,但与对照差异不显著。但由类胡萝卜素与总叶绿素质量分数比可知,各品种的比值均随胁迫强度的增加呈上升趋势,在轻度干旱(6 d)时,Rp、Gr、Os、Gd的类胡萝卜素与总叶绿素质量分数比分别比对照提高了36.8%、27.8%、23.5%、20.0%,而在严重干旱(12 d)时,4个品种的比值分别比对照升高了47.3%、38.9%、35.3%、25.0%,Rp与Gr品种上升幅度较大(P<0.05)。

2.2 干旱胁迫对北美冬青相对电导率及丙二醛、H2O2、超氧阴离子自由基质量分数的影响

随着干旱胁迫时间增加,4个北美冬青品种的相对电导率均呈上升趋势。但轻度干旱胁迫(6 d)时,Rp、Os的相对电导率上升幅度较大,分别比对照提高了55.9%、83.6%;在严重干旱(12 d)时,各品种的相对电导率都显著增加(P<0.05),Rp、Gr、Os、Gd分别比对照增加了140.4%、131.7%、170.4%、158.2%,Gr与Rp品种的电导率增加相对较低(表2)。

表2 干旱胁迫时4个北美冬青品种的相对电导率及丙二醛、H2O2、超氧阴离子自由基质量分数

与相对电导率变化的趋势相似,随着干旱胁迫强度的增加,4个品种的丙二醛质量分数也整体呈上升趋势。在干旱胁迫6 d时,各品种丙二醛质量分数的变化幅度不大,都与对照无显著差异。但在干旱胁迫12 d(重度干旱)时,Rp、Gr、Os、Gd 4个品种的丙二醛质量分数都大幅度上升,分别比对照增加了23.3%、37.9%、33.1%、40.6%(表2)。

由表2可见,各品种的H2O2和超氧阴离子自由基的质量分数大多随着干旱胁迫时间的增加而增加,在干旱胁迫12 d时达到最大值。在轻度干旱(6 d)时,Rp、Gr、Gd的H2O2质量分数与对照相比没有显著变化,只有Os品种的H2O2质量分数比对照显著下降了32.0%;而在严重干旱(12 d)时,Rp、Gr、Os、Gd 4个品种H2O2质量分数都显著增加,分别比对照提高47.0%、89.5%、7.4%、23.8%,Gr的H2O2质量分数增加最多。在轻度胁迫(6 d)时,Gr和Os品种超氧阴离子自由基的质量分数显著增加,分别比对照增加了50.3%、23.6%;而严重干旱胁迫时,Rp、Gr、Os、Gd的超氧阴离子自由基都出现显著增加,分别比对照增加57.7%、124.6%、131.0%、104.9%,Rp的增加值最小。

2.3 干旱胁迫对北美冬青抗氧化酶活性的影响

由表3可见,各个品种的超氧化物歧化酶活性均随着干旱胁迫强度的加大而增强,Rp、Gr增加的相对较小(小于20%),而Os、Gd品种的酶活性显著增加,在轻度胁迫时,分别比对照提高了29.1%、35.7%;在严重胁迫时,Rp、Gr、Os、Gd的超氧化物歧化酶活性显著增加,分别比对照提高了16.3%、20.1%、50.0%、58.0%,差异达极显著水平(P<0.01),其中,Gd的超氧化物歧化酶活性提高的最多,Rp的超氧化物歧化酶活性提高幅度低于其他品种。

表3 干旱胁迫时北美冬青4个品种的抗氧化酶活性

与超氧化物歧化酶活性变化不同,各品种的过氧化物酶活性在轻度干旱(6 d)时大幅提高,Rp、Gr、Os、Gd的过氧化物酶活性分别比对照提高了146.9%、278.3%、138.9%、13.9%,Gr提高的最多;而在严重干旱(12 d)时,Rp、Gr、Os、Gd的过氧化物酶活性均高于对照,分别比对照增加了115.6%、89.1%、33.7%、4.0%(与对照无显著差异),Rp与Gr品种增加的幅度较大(P<0.05)。但与轻度胁迫相比,4个品种的过氧化物酶活性都出现下降,分别比轻度干旱时下降了12.7%、50.0%、44.0%、8.7%(表3)。

过氧化氢酶活性与超氧化物歧化酶、过氧化物酶变化也不同,Rp、Gr 2个品种在轻度和严重干旱胁迫时,过氧化氢酶活性都出现降低,且活性在严重胁迫时远低于轻度胁迫。Rp、Gr在严重干旱胁迫时,过氧化氢酶活性分别比对照降低了69.5%、33.0%,比轻度胁迫降低了65.8%、18.4%。Os、Gd的过氧化氢酶活性在轻度胁迫时也出现降低,分别比对照降低了45.1%、40.7%,但在严重干旱情况时,Os、Gd的过氧化氢酶活性又出现上升,分别比对照提高了71.2%、6.7%(差异不显著),比轻度胁迫时分别提高了211.9%、80.0%,差异显著(P<0.05)。

随着干旱胁迫时间的增加,各品种的谷胱甘肽还原酶(GR)活性呈上升趋势。在轻度干旱胁迫时,只有Rp的谷胱甘肽还原酶活性与对照和严重干旱处理都存在显著差异(P<0.05),其活性比对照提高了46.8%。而在严重干旱处理(12 d)时,Rp、Gr、Os、Gd的谷胱甘肽还原酶活性都显著提高(P<0.05),分别比对照提高了108.9%、225.4%、151.6%、80.5%,Gr的活性上升幅度最大,差异非常显著(表3)。

2.4 干旱胁迫对北美冬青品种抗氧化剂质量分数的影响

由表4可见,还原型谷胱甘肽(GSH)的质量分数在轻度干旱胁迫时,只有Gr出现了显著增加,比对照提高了35.6%,其他3个品种虽低于对照,但差异未达到显著水平;在严重干旱胁迫(12 d)时,4个品种的还原型谷胱甘肽质量分数都有所增加,但只有Gr、Os、Gd与对照存在显著差异(P<0.05),分别比对照增加了274.3%、22.7%、12.2%,特别是Gr品种,增加了2.74倍,与谷胱甘肽还原酶的活性相对应。

表4 干旱胁迫时北美冬青抗氧化剂质量分数

在轻度干旱胁迫时,只有Os品种的抗坏血酸(AsA)质量分数显著增加(P<0.05),比对照提高了58.7%,而其他3个品种的抗坏血酸质量分数与对照不存在显著差异;在严重干旱胁迫时,Gr、Os抗坏血酸质量分数都显著高于对照和轻度胁迫处理的,分别比对照提高了174.8%、104.6%、Gr提高的最多,而Rp、Gd品种的变化不显著(表4)。

2.5 15个指标间的相关性分析

对干旱胁迫时的15个指标进行相关性分析,结果见表5(去除相关性不显著的数据和指标)。其中,抗坏血酸质量分数与还原型谷胱甘肽质量分数、谷胱甘肽还原酶活性、H2O2质量分数、超氧阴离子自由基质量分数呈极显著的正相关,与叶片含水量呈极显著的负相关;谷胱甘肽还原酶活性与还原型谷胱甘肽质量分数、超氧阴离子自由基质量分数之间呈显著的正相关,与总叶绿素质量分数、类胡萝卜素质量分数、叶片含水量之间呈显著负相关;还原型谷胱甘肽质量分数与H2O2质量分数和超氧阴离子自由基质量分数间呈正相关,与叶片含水量呈负相关;H2O2质量分数与超氧阴离子自由基质量分数呈正相关,与叶片含水量呈负相关;丙二醛质量分数与超氧阴离子自由基质量分数、相对电导率呈正相关,与叶片含水量呈负相关;总叶绿素质量分数与类胡萝卜素质量分数呈极显著的正相关(表5)。

表5 各指标间的相关性分析结果

2.6 4个北美冬青品种抗旱性综合评价

采用主成分分析方法,对13个干旱性状(叶绿素a、b质量分数比与类胡萝卜素、总叶绿素质量分数比指标没有计入)指标换算出的耐旱系数进行主成分分析,将多个相关指标转换为4个独立的综合指标,并对4个品种的耐旱性进行综合评价(表6、7)。由表6可见,对处理后的数据取大于1的特征值,可获得4个主成分,其累计贡献率达91.524%,表明4个主成分可以把13项指标91.524%的信息表现出来。第一主成分特征值为6.202,贡献率为47.707%,载荷较高(综合指标系数绝对值大于0.5)的正值指标有超氧阴离子自由基质量分数(0.921)、还原型谷胱甘肽质量分数(0.859)、谷胱甘肽还原酶活性(0.775)、H2O2质量分数(0.766)、抗坏血酸质量分数(0.731);而过氧化物酶活性(-0.881)、总叶绿素质量分数(-0.848)、丙二醛质量分数(-0.744)、叶片含水量(-0.701)为负向指标,因此,第一主成分反映的是抗氧化与叶绿素方面的信息。第二主成分特征值为2.599,贡献率为19.996%,载荷较高的指标有,叶片含水量(0.683)、类胡萝卜素质量分数(0.838)、H2O2质量分数(0.580)为正值指标,过氧化氢酶活性(-0.527)为负值指标,主要反映与H2O2的作用相关的信息。第三主成分特征值为2.031,贡献率为15.625%,主要指标有超氧化物歧化酶活性(0.870)、相对电导率(0.793)。第四主成分特征值为1.065,贡献率为8.196%,主要指标有谷胱甘肽还原酶活性(0.545)。

表6 干旱胁迫时4个冬青品种主成分分析结果

表7 干旱胁迫时4个冬青品种综合指标系数

根据各主成分特征值、主成分因子得分,构建4个北美冬青品种的综合得分计算公式:D=0.521×U(X1)+0.218×U(X2)+0.171×U(X3)+0.090×U(X4)。4个北美冬青在干旱处理6 d(轻度干旱)时的耐旱性综合排名从前到后依次为Gr、Rp、Gd、Os;干旱处理12 d(严重干旱)时的耐旱性综合排名从前到后依次为Gr、Rp、Os、Gd。平均后耐旱性总排名顺序从前到后依次为Gr、Rp、Os、Gd(表8)。

表8 干旱胁迫时4个品种耐旱性评价结果

3 讨论与结论

植物耐旱性为数量遗传性状,受多基因调控,因此,对于耐旱性的评价,应该用尽可能多的指标来综合评定,从而减少单个指标对评定植物耐旱性所造成的片面性[18-19]。目前,植物耐逆性评价方法主要有隶属函数平均值法[20-21]、主成分分析法[22]、灰色度关联分析法[23]、熵值法和熵权TOPSIS法[24]等。综合来看,主成分分析法应用较多,更具有可靠性和普遍性。本研究通过将指标的原始测定值换算成耐旱系数,并通过主成分分析法进行综合评价,得出4个北美冬青的耐旱性强弱的顺序依次为Gr、Rp、Os、Gd,评价结果与实际野外观察到的相符合,可靠性较强。

植物叶片含水量和光色素质量分数是植物生长的2个重要指标。干旱情况时,叶片会因失水出现枯萎现象,失水少、萎缩轻的品种耐旱性更强[25]。已有研究表明,随着干旱程度的加剧,参与光合色素代谢的基因显著下调,导致光合色素的降解速度超过合成速度,因而叶绿素和类胡萝卜素的质量分数都减少,尤以叶绿素b更为敏感[14-15]。本研究也发现,4个品种的叶绿素质量分数、叶片含水量、类胡萝卜素质量分数在干旱情况都出现了下降,特别是在严重干旱情况时,下降幅度更大,其中,Gr降低幅度较其他3个品种大。但从叶绿素a、b质量分数比可见,干旱情况时,4个品种该指标都出现了显著上升,特别是Rp与Gr上升幅度较Os、Gd大,说明干旱胁迫对北美冬青叶绿素b的影响较大,而对主要色素叶绿素a的影响较小,即干旱对Rp和Gr的伤害低于Os和Gd。类胡萝卜素具有保护叶绿素、提高抗氧化能力的作用[6],本研究中还发现,干旱胁迫提高了各品种的类胡萝卜素、总叶绿素质量分数比,表明类胡萝卜素质量分数较叶绿素降低的程度低,仍然是Rp与Gr品种上升的幅度较大,说明Rp与Gr抵抗力较Os、Gd强。这些结果与北美冬青、豇豆(Pisumsativum)和文冠果(Xanthocerassorbifolium)等在干旱处理的结果相一致[3,15,26]。

植物干旱伤害的最初和关键部位是膜系统,而相对电导率(REC)与膜脂过氧化产物是判定植物受逆境胁迫损伤程度的重要评价指标,在某种程度上,相对电导率和膜脂过氧化产物质量分数高的植物耐旱性较弱[27-28]。本研究发现,严重干旱胁迫时,4个品种的相对电导率和丙二醛质量分数都比对照出现了显著增加,其中,Os、Gd的相对电导率和丙二醛质量分数的增加百分率都高于Rp、Gr,说明干旱对Rp、Gr的细胞膜伤害低于Os、Gd,即Rp、Gr具有较强的抗氧化能力。