捻转血矛线虫对伊维菌素的耐药机制

张艳敏,赵东旭,王文龙*

(1.内蒙古农业大学兽医学院/农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室,呼和浩特 010010;2.内蒙古大学生命科学学院,呼和浩特 010021)

牛、羊和其他反刍动物采食附着有捻转血矛线虫(Haemonchuscontortus)三期幼虫(L3)的牧草,从而引起捻转血矛线虫病。在畜体内,该虫通过矛型齿划破消化道黏膜,以吸食血液为生[1],被感染的动物高度贫血、极度消瘦,甚至死亡[2-3],造成严重的经济损失[4]。捻转血矛线虫在全球范围内广泛流行至今,仍然是畜牧业的一大难题,对于该病通常是采用化学药物进行驱虫治疗[5]。但是近年来,国内外大量研究报道H.contortus对阿苯达唑、伊维菌素和左旋咪唑等常用驱虫药均产生了耐药性,甚至出现了多重耐药性[6]。早期在美国,于1961年已报道H.contortus对苯并咪唑类药物产生耐药性,20世纪80年代在澳大利亚发现H.contortus对伊维菌素产生了耐药性[7],另外新药物莫奈太尔用来治疗H.contortus效果不佳,且也产生了耐药性[8]。时至今日,耐药性的研究进展仍未取得重大突破,其他防治方法如中草药方剂、新药研制及疫苗预防也有相应的研究进展,但同时伴随诸多问题,如新药对宿主的毒性及药物残留、疫苗的成品上市时间等,目前还并不能取代伊维菌素、阿苯达唑等常用驱虫药的治疗方案,所以解决消化道线虫的主要方案仍然是选择常用药进行驱虫治疗。另外,发现关键耐药靶点还可以为药物改造带来新的方向,因此解决耐药性的问题仍然是目前研究方向的重中之重。

1 伊维菌素耐药基因的相关机制研究

伊维菌素(ivermectin, IVM)作为一种抗寄生虫药物,具有广谱、高效和低毒等特点,对线虫、节肢动物等体内外寄生虫均具有良好的驱杀作用。其作用机理主要包括两个方面,第一种是作用于虫体神经递质γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid, GABA)受体,其亚单位分布于H.contortus的腹部神经索和头部的部分神经元,引起虫体运动活力减弱;第二种是通过配体门控氯离子通道(GABA或谷氨酸门控氯离子通道)介导产生麻痹作用,与谷氨酸门控氯离子(Glu-Cl)高度结合,在氯离子膜传导上是呈现缓慢、不可逆的增加,作用于咽泵,影响虫体摄食;作用于肌肉组织,使其停留在宿主体内偏好部位能力受限[9-10]。伊维菌素在长期应用过程中,存在不规范使用的现象,导致耐药虫株的出现。捻转血矛线虫对伊维菌素产生耐药性在全球范围均有报道,而且耐药性的产生越来越严重,针对伊维菌素耐药性机制研究的报道也越来越多,现综述如下。

1.1 GABA门控Cl-通道与耐药性

IVM对线虫神经肌肉系统的影响一直是IVM作用机制研究的重点,在线虫的神经肌肉系统中,γ-氨基丁酸(GABA)被认为是主要的抑制性神经递质。因此,神经递质受体一直是研究的主要对象。GABA门控氯离子通道是伊维菌素的作用部位之一,它的生物学靶点是一种五聚体配体门控离子通道,在线虫和节肢动物的神经和肌肉细胞中高度表达,但在脊椎动物中不存在。低浓度的伊维菌素不可逆地通过葡萄糖醛酸受体激活Cl-内流[11],改变细胞膜对Cl-的通透性从而阻断神经肌肉传导,导致虫体弛缓性麻痹或饥饿致死[12]。

GABA受体参与伊维菌素耐药性的产生已经从不同的方向进行了验证,其中Hco-UNC-49基因及其UNC家族研究众多,且探索了该基因的分子动力学及其突变结合位点[13-14],可以作为后续探索IVM耐药性机理及驱虫药新靶点的一个重要研究方向。据报道,捻转血矛线虫中对伊维菌素敏感基因HG1A和耐药基因HG1E为两个等位基因,分别编码GABA受体的a和c亚基,发现 HG1/GABA-1受体的共表达在耐药虫株中对GABA作用发挥呈负相关,即伊维菌素增强了GABA-1/HG1A受体的电流,但减弱了GABA-1/HG1E受体的GABA反应[9]。来自H.contortus的GABA门控Cl-通道的Hco-UNC-49,是秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)的神经肌肉受体的正构体,使用双电极电压钳测试了几种杀虫剂和几种驱虫药对通道功能的影响,发现Hco-UNC-49通道被氟虫腈和印防己毒素阻断,被IVM和莫西菌素适度增效,并被高浓度的哌嗪激活[15-16]。IVM还可抑制C.elagans肌肉的 GABA 和 L-AchR(对左旋咪唑敏感烟碱受体)受体[17]。但是目前发现GABA通道在伊维菌素耐药性的相关研究报道中,对捻转血矛线虫的耐药性研究似乎到了瓶颈期,而在小鼠或其他物种关于伊维菌素的耐受性报道中,GABA通路的研究更为广泛新颖。

1.2 谷氨酸门控Cl-通道与耐药性

IVM可以激活或延缓性麻痹谷氨酸门控的Cl-通道[18],还可以作为谷氨酸的激动剂来增加谷氨酸门控氯离子通道的开放频率。在低浓度时,可以诱导电流并增加神经递质;在高浓度时,可以打开离子通道,从而增强细胞膜对氯离子的通透性,最终导致神经传导受阻,肌肉松弛麻痹。在蠕虫咽部肌肉的蠕动被阻断后,蠕虫的进食受到干扰或阻碍,最终导致饥饿和死亡[19],所以一般认为,IVM对咽部肌肉的麻痹作用是通过谷氨酸门控的氯离子通道受体(GluClRs)实现的。2019年,Atif等[20]在突触和单体受体水平上研究了H.contortus的GluClRs的不同异构体表达,发现IVM能增强突触电流的振幅和衰减,并延长了单一受体的活动,表明伊维菌素可以通过与细胞膜相互作用更好地与GluClRs结合。

在许多情况下,耐药性是高度可遗传的,在药物选择下可能会出现抗蠕虫药的进化[21]。与捻转血矛线虫敏感虫株相比,调控伊维菌素耐药虫株的谷氨酸门控Cl-通道的基因序列发生了突变,在80～170 bp处有多个突变;192～207 bp处有碱基丢失[22]。后续有研究通过遗传学研究确定了主要的谷氨酸门控受体基因,这些基因(glc-1、avr-14和avr-15)的联合突变导致了IVM产生极高的抗性[23]。通过全基因组关联和连锁图谱分析阿维菌素的基础反应变化,确定了V号染色体上的3个数量性状基因位置(QTL)[24]。其中一个QTL是由谷氨酸门控氯离子通道基因glc-1的变异引起的,说明该基因glc-1可以作为后续伊维菌素耐药靶点展开研究。

另外,在探索H.contortus对伊维菌素产生耐药性的机制中,发现C.elegans可以用于识别耐药性候选基因。使用近等基因系(NILs)独立验证和缩小每个QTL,并使用CRISPR-Cas9技术对候选基因进行测试,在H.contortus的V号染色体上寻找伊维菌素反应QTL的同源基因,发现C.elegans和H.contortus两个物种的QTL中具有共同的40个基因[24]。所以在研究捻转血矛线虫对伊维菌素的耐药性中,结合模式线虫进行耐药基因的共同筛选并验证,可以增加获取关键基因的概率。此外,由于伊维菌素的作用机制之一是通过配体门控氯离子通道介导使虫体产生麻痹作用,所以部分研究者认为GABA和Glu之间可能是协同作用参与捻转血矛线虫对IVM耐药性的发生。

1.3 外排转运蛋白与耐药性

ATP结合盒(ATP-binding cassette,ABC)作为药物转运体超家族,其主要功能是排除有害物质、转运离子和摄取营养物质等[25]。其中,ABC相关转运蛋白的过度表达参与了伊维菌素耐药性的产生[26],与H.contortus对伊维菌素敏感虫株相比,耐药虫株Pgp-A基因表现出更高的表达水平[27]。以前研究者普遍认为ABC转运蛋白可以保护蠕虫免受伊维菌素等驱虫药的侵害[28],然而在幼虫迁移试验中,研究者在耐药虫株中观察到IVM药物暴露反应与之前的报道存在一些差异,这表明在幼虫中,ABC转运蛋白基因转录水平和外排活性的简单测量并不一定能表明转运蛋白途径能够保护蠕虫免受驱虫剂的伤害。说明ABC转运蛋白是可以在耐药中发挥作用,但是不同的mRNA的作用能力有所差异,目前报道的基因还不足以说明该基因在耐药性产生过程中发挥关键作用,可见伊维菌素的抗性是极其复杂的。另外,ABC转运蛋白在物种内部和不同物种之间的作用能力有所不同。通过比较耐伊维菌素的C.elegans(IVR10)和野生型虫株(N2)的转录水平发现,不同的ABC转运蛋白可能在调节IVM对虫体咽泵、运动和产卵量的影响中发挥作用,其中基因mrp-1和基因half-2的下调影响较强。然而,在IVR10虫株中,相关基因的表达下调对IVM导致虫体死亡并没有显著影响[29]。表明,这些ABC转运蛋白基因及其产物可能在调控IVM效应中发挥作用,但不是单独负责IVM抗性的关键基因。2021年,Sengthong等[30]建立了圆线虫IVM耐药性诱导小鼠模型,发现ABC亚型基因(ABCA、ABCF和ABCG)在IVM耐药株中的表达水平明显高于易感株。上述可见外排转运蛋白确实在不同线虫对IVM产生耐药性中发挥作用,尤其在捻转血矛线虫对伊维菌素耐药虫株中研究最为广泛,但是目前关于这一可能耐药机制的相关基因众多,且调控能力及发挥作用强度仍是未知。

P-糖蛋白 (P-glycoprotein),是ABC转运体中最具代表性的蛋白。其作为一种跨膜转运蛋白,以外排泵的方式从细胞中排出疏水性外源物质, 降低了伊维菌素在Glu-Cl受体作用位点的局部药物浓度[31],同时可以去除线虫细胞中的有毒分子,在伊维菌素耐药性中发挥了重要作用[32]。有研究报道Hco-Pgp-16基因可能有助于捻转血矛线虫对IVM的耐药性相关研究[33]。在后续研究中发现,外排转运蛋白家族Pgp-9系列基因似乎已被证实参与耐药性的产生,无论是在L3还是成虫的耐药性产生中,均发现了Pgp-9基因。在捻转血矛线虫耐IVM的L3中,pgp-1、pgp-9.1和pgp-9.2结构性过表达[34]。Kellerov等[35]在2019年发现成年H.contortus中p-gps的构成性表达存在明显差异,在IVM作用下,雄虫的pgp-9.2和pgp-10表达均显著增加。Mate等[26]于2022年发现,与敏感虫株相比,pgp-9.2基因在耐药虫株中的表达有明显差异,这与之前的报道一致,更进一步表明Pgp-9可能是导致IVM抗性的多基因参与的最相关候选基因之一;同年Pacheco等[36]发现柠檬烯参与了Pgp-9基因的调控,它可以将多重耐药H.contortus株的IVM活性恢复到敏感虫株的水平。柠檬烯是柑橘皮的主要化合物之一,如果与IVM联合使用,既安全又经济,又会提高IVM对耐药H.contortus的疗效。另外用量不准确的使用IVM对绵羊进行驱虫也可能会导致耐药性的发展,因为这个过程它会增加H.contortus成虫中外排转运蛋白的表达(同时临床应用也需要考虑宿主的影响,据报道60 mg·kg-1的槲皮素可从mRNA和蛋白质水平显著增加大鼠空肠P-gp的表达,降低伊维菌素在大鼠空肠的渗透性[37])。综上,外排转运蛋白家族Pgp-9系列基因可以作为今后耐药性研究的主要方向,继续探索外排转运蛋白对耐药性的影响机制。

1.4 其他相关耐药机制

捻转血矛线虫对药物敏感性的差异,还与药物在线虫体内的扩散和积累有关(药代动力学)。也有研究认为IVM剂量水平相关疗效差异与基因的变异和H.contortus在皱胃内不同位置的药物积累的潜在差异有关[38]。捻转血矛线虫的治疗主要使用数量有限的驱虫药,然而,这些驱虫药的疗效还可能会受到在兽医寄生虫中和人类寄生虫中出现的耐药性的限制[39]。

药物代谢酶、生物转化酶以及异物代谢酶(XMEs)调控众多药物的生物活性和作用行为,可帮助消除大量潜在有毒的外源性化学物质、去除内源性代谢的有毒副产物以及控制内源性信号分子的水平和分布[40]。其中细胞色素P450、UGTs和GSTs家族作为对有害异生物的主要防御系统[41-42],被认为其有助于耐药性的研究发展。2020年刘阳[43]通过转录组学与蛋白组学关联分析筛选出可能耐药基因,并结合RNAi试验确定了Pgp-9、GST和UGT三个基因与捻转血矛线虫对伊维菌素产生耐药性相关。当然,还有一些研究支持Cyps对IVM抗性具有潜在贡献, 当使用胡椒基丁醚抑制剂抑制Cyps的活性并同时接触IVM时,对IVM敏感和耐药的古柏线虫和奥斯特线虫的幼虫发育会完全被抑制,并且幼虫迁移明显减少[44]。CyP450可通过增加酶的表达量、酶活力的改变加快机体对药物的代谢,使机体产生一定的适应性,从而产生耐药性[45]。

在伊维菌素耐药性机制的研究过程中,耐药基因的确定似乎容易受到地理环境及时间的影响,导致耐药基因的暂时性与不稳定性。早在2003年,通过对H.contortus的电子显微镜分析显示,与对IVM敏感的线虫相比,对IVM耐药的线虫的纤毛感受器(amphid cilia)更短[46],这充分表明,感受器在线虫对IVM进入和药物敏感性中发挥作用。在2014年,一项研究发现不同地理来源的对IVM耐药的H.contortus和C.elegans中,dyf-7基因是纤毛感受器形成的关键,作者还发现了H.contortus的dyf基因与IVM抗性之间存在关联[47]。长期暴露于大环内酯类莫西菌素的线虫也会导致感受器缺陷,进一步确定了线虫感受器与线虫耐药性之间的联系[48]。尽管莫西菌素与IVM同属于大环内酯类药物,但莫西菌素属于米尔贝霉素类,IVM属于阿维菌素类,莫西菌素目前耐药性产生不及伊维菌素。后续于2018年Elmahalawy等[49]比较了来自瑞典同一农场的捻转血矛线虫在IVM处理前后的dyf-7等位基因的频率,没有发现dyf-7与IVM抗性水平之间存在相关性的证据。由此说明,已报道的相关耐药基因还需进一步证明。

伊维菌素作为几种配体通道的正变构调节剂,主要包括谷氨酸门控的氯离子通道(Glu-Cl)、γ-氨基丁酸a型受体(GABAA)、甘氨酸受体、神经元α7-烟碱受体和嘌呤能P2X4受体[50]。前两种通道已被认为可能作为耐药性产生机制进行广泛研究,后续研究中发现,其他三种配体通道也参与了IVM对H.contortus不同程度的作用过程。H.contortus基因组显示出大量的半胱氨酸-环(Cys-loop)家族受体,且被一系列不同的神经递质和伊维菌素激活,2023年研究者从H.contortus中鉴定出一种Cys-loop受体LGC-39,这是一种新型的胆碱能敏感配体门控Cl-通道,属于已命名的GGR-1 (GABA/甘氨酸受体-1) Cys-loop受体[51]。另外嵌合受体(包含伊维菌素敏感P2X4R和伊维菌素不敏感P2X2亚基结构域)的试验证明跨膜结构域在IVM的变构调节中发挥关键作用[52]。目前,在Cys-loop受体家族和P2X受体家族中已经确定了几个变构位点,所以证实了当IVM结合高亲和力的结合位点时,即通过增加通道打开的概率来增加反应,降低通道脱敏的概率;而当它结合低亲和力的结合位点时,它通过稳定受体的开放构象来增加失活时间[53]。这些受体位点可能代表未来重要的药物靶点或耐药研究新方向。

2 伊维菌素耐药非编码RNA的相关研究

通过查阅文献发现近几年耐药性的研究进展似乎遇到了瓶颈,尽管已经从多角度[54-57]进行研究,但是截至目前,仍然没有确切的耐药机制。由于非编码RNA研究的崛起,且已被报道参与增殖、凋亡、迁移、侵袭、转移和耐药性等各种生物学和病理学过程[58],所以近年来有研究将H.contortus对IVM耐药性相关研究扩展到非编码RNA。非编码 RNA 可分为基础结构型ncRNA和调控型ncRNA两种主要类型。根据RNA的长度,调控型ncRNA主要可分为小ncRNA (small ncRNA,18～200 nt)和lncRNA (long ncRNA, >200 nt)[59-61]。那么非编码RNA在耐药性相关研究中进展如下。

2.1 miRNA与耐药性的相关研究

早有研究表明,一些miRNA被认为与耐药相关,初步认为其可能参与改变ABC外排转运蛋白的表达[62],而这一耐药机制也与伊维菌素的耐药机制之一相似,可见小RNA与IVM的耐药性有着密不可分的联系。

通过对节肢动物[63]的药物抗性的大量研究发现,其涉及多种生物学过程,尤其是miRNA与解毒基因细胞色素p450之间的关系,细胞色素P450在H.contortus对IVM的耐药性研究中也早有研究报道,但是miRNA在调控关键耐药分子信号通路的作用仍未明确。Gillan等[64]研究了对伊维菌素产生耐药性的4株H.contortus,分别是来自地理位置不同的2株耐药虫株、由易感亲本和耐药亲本经多轮回交产生的2株耐药虫株。与敏感虫株相比,4株耐药虫株的hco-miR-9551的表达量均显著增加。2023年温海峰等[65]利用全转录组测序分析,探究H.contortus对IVM敏感虫株与耐药虫株的miRNA差异转录谱,筛选出差异显著的miRNA共375个,其中253个转录上调,122 个转录下调。有研究发现不同miRNA在H.contortus和C.elagans的虫体发育不同时期的表达量是不同的[66-67]。说明不同的miRNA在虫体不同时期参与了机体不同部位的多功能调节,由此可见miRNA在不同物种间无论是生物学过程还是耐药性产生过程都有不可忽视的作用。

2.2 lncRNA与耐药性的相关研究

lncRNA参与了捻转血矛线虫及节肢动物相关耐药性的产生过程,并且在解毒或其他毒素相关代谢中发挥一些未知作用。在捻转血矛线虫对伊维菌素的耐药性研究中,仅构建了H.contortus对IVM部分耐药相关通路的lncRNA-miRNA-mRNA调控网络[68]。然而,lncRNA已被揭示与节肢动物的药物耐药性机制有关[69],先后有研究者[70-71]发现小菜蛾的lncRNA在对三种不同类型的杀虫剂(有机磷类、苯吡唑类和Bt类)产生耐药性时的表达谱发生了改变,这三种杀虫剂的作用模式分别为灭活乙酰胆碱酯酶、靶向GABA门控的Cl-通道和裂解中肠细胞,其中靶向GABA门控Cl-通道也是H.contortus对IVM产生耐药性的机制之一。另外在对驱虱药产生耐药性的海虱研究中发现,一部分lncRNA通常与药物反应相关基因(如ABC转运蛋白、细胞色素p450和谷胱甘肽S-转移酶等)有很强的转录相关性[72-73],后续探讨了参与海虱耐药生物学过程相关的miRNA-lncRNA间的相互作用[74-75]。综合上述这些研究结果,初步说明lncRNA可能在不同生物产生耐药性的过程中发挥关键作用,也进一步支持lncRNAs可能在不同驱虫药耐药发展中发挥作用的假说[70]。

目前,关于miRNA-lncRNA间的相互作用及如何参与耐药性的产生证据仍然不足,尽管有研究认为这两类非编码RNA可能涉及许多耐药靶点,后续关于lncRNA-miRNA-mRNA、lncRNA-mRNA等在耐药性的研究中还需要大量的试验方法进行支持验证。另外从遗传学的角度讲,长久的耐药性是可遗传的,耐药虫株和敏感虫株的两组基因或许不同。在生物学研究中,普遍认为DNA转录成mRNA,mRNA编码蛋白质,蛋白质决定表型,但是在RNA的分岔口,还有一群非编码RNA在起到运输、抑制、推动和调控等作用。目前,关于伊维菌素的相关耐药基因及耐药靶点较多,且其他可能耐药调节因子还未继续研究,所以要将目前已报道的IVM耐药机制相关的mRNA与非编码RNA相结合,才能更好更快地找出关键耐药基因或耐药通路。

3 展 望

关于捻转血矛线虫对伊维菌素的耐药性相关研究已经进展多年,且已报道几种可能耐药通路及其相关耐药基因,比如,GABA门控氯离子通道中的UNC-49基因、Glu-Cl中的glc-1基因、外排转运蛋白中的pgp-9基因和异物代谢细胞色素P450等。从现有研究可知,耐药性的产生是多基因参与和多途径调控,但是仍然没有确定的耐药机制和耐药基因。近年来,随着非编码RNA在耐药性相关研究的增多,研究者也意识到单独研究非编码RNA在耐药性中的调控关系是片面的,独立的针对单一基因或调控因子进行此类机制研究也是不全面的。所以将基因,甚至是多个基因,与非编码RNA相结合,开展耐药性机制研究可能是更为合理、更有可能取得突破性进展的研究方案。