microRNA-338-3p抑制HepG2肝癌细胞的迁移和侵袭

念家辉 韦卿 刘国满 黄梓华 黄理政 浦涧

基金项目：广西自然科学基金（2020GXNSFAA259019）

第一作者简介：念家辉，男，医学学士，在读硕士研究生，研究方向：肝脏疾病基础与临床。E-mail：123554419@qq.com

▲通信作者：浦涧。E-mail：pujianym@163.com

［本文引用格式］念家辉，韦卿，刘国满，等.microRNA-338-3p抑制HepG2肝癌细胞的迁移和侵袭［J］.右江医学，2024，52（3）：198-202.

【摘要】  目的  研究microRNA-338-3p对HepG2肝癌细胞迁移、侵袭和上皮间质转化的影响。

方法  取HepG2肝癌细胞，随机分为三组：control组（未转染）、vector组（转染空质粒）、OE组（转染microRNA-338-3p质粒），分别取生理盐水、空质粒、microRNA-338-3p转染，培养48小时。实时荧光定量PCR（qPCR）检测microRNA-338-3p的转染效率；划痕实验检测细胞的迁移指数；Transwell法检测细胞的侵袭能力；蛋白质印迹法（Western blot实验）检测细胞E-cadherin、N-cadherin的相对蛋白表达量。

结果  （1）microRNA-338-3p的转染阳性率超过90%，符合实验标准。（2）HepG2肝癌细胞的迁移指数，control组与vector組相比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；OE组与control组、vector组相比较，迁移指数明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。（3）HepG2肝癌细胞的侵袭能力，control组与vector组相比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；OE组HepG2与control组、vector组相比较，侵袭能力显著下降，差异有统计学意义（P＜0.001）。（4）E-cadherin相对蛋白表达量，control组与vector组相比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；OE组与control组、vector组相比较，E-cadherin相对蛋白表达量均增高，差异有统计学意义（P＜0.05）。（5）N-cadherin的相对蛋白表达量，control组与vector组相比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；OE组与control组、vector组相比较，N-cadherin相对蛋白表达量减少，差异均有统计学意义（P＜0.01）。

结论  （1）microRNA-338-3p可抑制HepG2肝癌细胞的迁移、侵袭能力；（2）microRNA-338-3p通过促进E-cadherin蛋白表达并抑制N-cadherin蛋白表达，从而抑制HepG2肝癌细胞的上皮间质转化。

【关键词】  微小RNA；肝细胞癌；迁移；侵袭

中图分类号：R735.7    文献标志码：A    DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2024.03.002

Inhibition of microRNA-338-3p on migration and invasion of HepG2 hepatoma cells

NIAN Jiahui1， WEI Qing2， LIU Guoman2， HUANG Zihua2， HUANG Lizheng2， PU Jian1▲

（1. Department of Hepatobiliary Surgery， Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for

Nationalities， Baise 533000， Guangxi， China; 2. Graduate School， Youjiang Medical

University for Nationalities， Baise 533000， Guangxi， China）

【Abstract】  Objective  To investigate the effects of microRNA-338-3p on migration， invasion and epithelial mesenchymal transformation of HepG2 hepatoma cells.

Methods  HepG2 hepatoma cells were extracted. They were randomly divided into three groups： control group （non-transfected）， vector group （transfected with empty plasmid） and OE group （transfected with microRNA-338-3p plasmid）. Normal saline， empty plasmid and microRNA-338-3p were transfected， respectively， and cultured for 48 hours. Real-time fluorescence quantitative PCR （qPCR） was used to detect the transfection efficiency of microRNA-338-3p. The migration index of cells was detected by scratch test. The invasive ability of cells was detected by Transwell method. The relative protein expression levels of E-cadherin and N-cadherin were detected by Western blot assay.

Results  （1） The positive rate of microRNA-338-3p transfection in this study was over 90%， which met the experimental criteria. （2） The migration index of HepG2 liver cancer cells showed no statistically significant difference between the control group and the vector group （P>0.05）. The migration index of the OE group was significantly lower than that of the control group and the vector group， and difference was statistically significant （P<0.01）. （3） There was no statistically significant difference in the invasion ability of HepG2 hepatocellular carcinoma cells in the control group and the vector group （P>0.05）; compared with the control group and the vector group， the invasion ability of HepG2 in the OE group significantly decreased， and the difference was statistically significant （P<0.001）. （4） There was no statistically significant difference in the relative protein expression of E-cadherin between the control group and the vector group （P>0.05）; the relative protein expression of E-cadherin in the OE group was higher than that in the control group and the vector group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. （5） There was no statistically significant difference in the relative protein expression of N-cadherin between the control group and the vector group （P>0.05）; compared with the control group and the vector group， the relative protein expression of N-cadherin decreased in the OE group， and the difference was statistically significant （P<0.01）.

Conclusion  （1） microRNA-338-3p can inhibit the migration and invasion ability of HepG2 liver cancer cells; （2） microRNA-338-3p inhibits epithelial mesenchymal transition in HepG2 liver cancer cells by promoting E-cadherin protein expression and inhibiting N-cadherin protein expression.

【Keywords】  microRNA; hepatocellular carcinoma; migration; invasion

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）作为最常见的原发性肝癌类型，目前已成为世界上第六大常见的癌症种类和第三大癌症死因［1］。尽管治疗方案不断取得进步，但许多HCC患者的预后仍然无法令人满意。上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是一种由上皮表型向间质表型的形态转化过程，与肝癌患者的预后密切相关，也是肝癌晚期转移的重要环节。在发生EMT的癌细胞中，N-cadherin和Vimentin等间充质标志物的表达上调，E-cadherin和ZO-1等上皮标志物的表达下调［2］。微小RNA（microRNAs，miRNAs）是一种长度为18～22个核苷酸的非编码单链小RNA，可以通过与靶mRNA的3'-UTR结合抑制基因表达，miRNAs异常表达对HCC细胞的增殖、迁移、侵袭和耐药的调控作用已经广泛受到关注，其中也包括EMT相关的癌症转移［3］。因此，本研究旨在通过体外干扰microRNA-338-3p表达，探究其对HepG2肝癌细胞迁移、侵袭和EMT的影响。

1  材料与方法

1.1  材料和试剂

人肝癌细胞HepG2来自中科院干细胞库；DMEM高糖培养基（Gibco公司，货号：C11995500BT）；青链霉素混合液（Solarbio公司，货号：P1400-100）；结晶紫染色液（Solarbio公司，货号：G1063-100 mL）、胰蛋白酶-EDTA消化液（Solarbio公司，货号：T1320-100）；胎牛血清（OriCell公司，货号：FBSST-01033-500）；慢病毒合成（上海吉玛制药技术有限公司，货号：ZLDZ003）；miRNA第一链cDNA合成试剂盒［生工生物工程（上海）股份有限公司，货号：B532451-0020］；实时荧光定量PCR试剂盒SYBR Green Master （Roche公司，货号：4913914001-5 mL）；TRIzol RNA提取試剂（赛默飞公司，货号：15596026CN）；引物合成［生工生物工程（上海）股份有限公司，货号：H001］；E-cadherin抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，货号：20874-1-AP）；N-cadherin抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，货号：22018-1-AP）和内参β-actin抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，货号：20536-1-AP）；Transwell小室8 μm PC膜（corning公司，货号：3422）；RIPA裂解液（上海雅酶生物医药科技有限公司，货号：PC102）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物技术股份有限公司，货号：P0010S）；ECL化学发光试剂盒（上海碧云天生物技术股份有限公司，货号：P0018S）。

1.2  细胞培养和处理

HepG2肝癌细胞复苏后，培养于含有10％胎牛血清的DMEM培养基中，置于37 ℃、5％CO2恒温培养箱中。每天常规换液1次，当细胞融合度达到90％左右即可按1∶2或1∶3传代处理，取对数生长期细胞进行下一步实验。

1.3  细胞转染和验证

取情况良好、对数生长期的HepG2肝癌细胞进行实验，将HepG2肝癌细胞以2×105个/well接种于六孔板中，每孔加入2 mL完全培养基，在37 ℃、5％CO2恒温培养箱中过夜。次日按MOI=20稀释病毒原液，将原细胞培养液移去，加入含有病毒稀释液的DMEM完全培养基。24小时后移去六孔板中的旧病毒液，加入新鲜DMEM完全培养基继续常规培养72小时，使用嘌呤霉素连续筛选2周。根据转染具体情况建立对照，分为control组（未转染）、vector组（转染空质粒）、OE组（转染microRNA-338-3p质粒）。使用荧光倒置显微镜观察转染后细胞的荧光表达效率；使用TRIzol试剂从HepG2肝癌细胞中提取总RNA，通过miRNA第一链cDNA合成试剂盒将总RNA逆转录为cDNA，以该cDNA为模板进行实时荧光定量PCR，反应条件为95 ℃ 10分钟，40个循环的95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s。以U6为内参，结果用2-△△Ct测定相对表达量。microRNA-338-3p上游引物：5-AACAGTGTCCAGCATCAGTGA-3，U6上游引物及通用下游引物由生工生物工程（上海）股份有限公司设计合成。

1.4  细胞划痕实验

预先对六孔板做好标记，将各组细胞按照5×105个/well的浓度接种到六孔板上，每孔加入2 mL完全培养基，放置于37 ℃、5％CO2恒温箱过夜。等待细胞贴壁并均匀铺满单层进行操作，使用无菌黄色枪头垂直平滑地划出划痕，用PBS将飘起的细胞充分洗去，再加入含有1％血清的DMEM培养基2 mL继续在37 ℃、5％CO2恒温箱中培养48小时。分别记录镜下0小时和48小时同一划痕区域的图片，计算迁移指数，迁移指数=（0小时的面积-48小时后的面积）/0小时的面积×100％。

1.5  细胞侵袭实验

使用无血清DMEM培养基将各组细胞的浓度稀释至2×105个/mL，充分重悬后每组分别取出100 μL的细胞悬液接种到预制好基质胶的Transwell小室中，加入600 μL 10％血清DMEM完全培养基，放置于37 ℃、5％CO2恒温箱继续培养24小时。使用甲醇对培养结束后的细胞进行10分钟固定，PBS漂洗两次后用0.1％结晶紫染色15分钟，再用PBS漂洗去多余的染料，轻柔地擦去Transwell小室上表面的细胞，最后对穿过膜的细胞进行计数。

1.6  蛋白质印迹法实验

提取各组HepG2肝癌细胞的总蛋白，通过BCA法测定蛋白浓度。制作7.5％SDS-PAGE凝胶，在每个加样孔中加入30 μg蛋白样本，浓缩胶电泳80 V，分离胶电泳120 V。湿转法设定恒流300 mA 1.5小时将蛋白条带转至PVDF膜上，快速封闭液封闭15分钟。加入一抗（E-cadherin、N-cadherin）后在4 ℃冰箱中孵育过夜，PBS漂洗三次后再加入二抗室温孵育1小时，PBS漂洗三次，显影后使用Image J软件分析蛋白条带灰度值，以β-actin作为内参计算蛋白相对表达量。

1.7  统计学方法

使用SPSS 22.0版统计学软件对实验结果进行统计分析。计量资料以均值±标准差（±s）表示，两样本均数间的比较采用t检验；多个样本间的比较采用单因素方差分析。检验水准设定为α=0.05，双侧检验。

2  结  果

2.1  microRNA-338-3p mimics慢病毒过表达效率检测

荧光倒置显微镜下观察各组HepG2肝癌细胞，成功被感染的细胞能够发出绿色荧光。vector组和OE组的荧光效率均超过90％。如图1A所示。使用RT-qPCR检测各组细胞的microRNA-338-3p表达量，control组与vector组相比microRNA-338-3p的表达量未见明显差异（P＞0.05）；control组与OE组microRNA-338-3p的表达量比较差异有统计学意义（P＜0.0001），OE组microRNA-338-3p的表达量显著上升；vector组与OE组microRNA-338-3p的表达量比较差异有统计学意义（P＜0.0001），OE组microRNA-338-3p的表达量显著上升。如图1B所示。

2.2  划痕实验检测microRNA-338-3p对HepG2肝癌细胞迁移能力的影响

划痕实验结果显示，microRNA-338-3p可以抑制HepG2肝癌细胞的迁移能力，将control组细胞48小时的迁移指数与vector组对比，差异无统计学意义（P＞0.05）；将control组细胞48小时的迁移指数与OE组对比，差异有统计学意义（P＜0.001），OE组的迁移能力显著小于control组；将vector组细胞48小时的迁移指数与OE组对比，差异有统计学意义（P＜0.01），OE组的迁移能力显著小于vector组。如图2A、2B所示。

2.3  Transwell侵袭实验检测microRNA-338-3p對HepG2肝癌细胞侵袭能力的影响

Transwell侵袭实验结果显示，microRNA-338-3p可以抑制HepG2肝癌细胞的侵袭能力。将control组的穿膜细胞计数后与vector组对比，两组差异无统计学意义（P＞0.05），而与OE组对比差异有统计学意义（P＜0.001），OE组的穿膜细胞计数显著小于control组，可以认为OE组的侵袭能力显著小于control组；将vector组的穿膜细胞计数后与OE组对比，差异有统计学意义（P＜0.001），OE组的穿膜细胞计数显著小于vector组，可以认为OE组的侵袭能力显著小于vector组。如图3A、3B所示。

2.4  蛋白质印迹法实验检测E-cadherin、N-cadherin蛋白表达

Western bolt实验结果显示，microRNA-338-3p可以促进上皮细胞标志物E-cadherin的表达，抑制间质细胞标志物N-cadherin的表达。control组和vector组的E-cadherin相比差异无统计学意义（P＞0.05）；control组和OE组的E-cadherin相比差异有统计学意义（P＜0.05），OE组的E-cadherin表达量高于control组；而vector组和OE组的E-cadherin相比差异有统计学意义（P＜0.05），OE组的E-cadherin表达量高于vector组。如图4A、4C所示。control组和vector组的N-cadherin相比差异无统计学意义（P＞0.05）；control组和OE组的N-cadherin相比差异有统计学意义（P＜0.01），OE组的N-cadherin表达量显著低于control组；vector组和OE组的N-cadherin相比差异有统计学意义（P＜0.05），OE组的N-cadherin表达量显著低于vector组。如图4B、4D所示。

3  讨  论

肝细胞癌是常见的恶性肿瘤之一，发病率和病死率都很高。近年有大量研究聚焦于肝细胞癌发生发展的机制，但是肝细胞癌进展的分子机制尚不明确，目前仍缺乏治疗晚期肝细胞癌的临床有效途径。目前一些研究表明microRNA-338-3p在抑制多种恶性肿瘤的特性中广泛发挥作用［4］，然而其介导肝细胞癌发生发展的机制尚未完全明确。miRNA在肿瘤的发生、发展和转移过程中起着关键作用，不同miRNA的生物活性调控了HCC细胞的侵袭和转移，有的充当促癌基因发挥作用，有的充当抑癌基因发挥作用，如过表达miRNA-96-5p可以促进SMMC-7721和MHCC-97H肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭［5］；过表达miRNA-299-3p可以抑制HCC细胞的增殖、侵袭和抗凋亡，并限制EMT和细胞干性［6］。因此，明确特定miRNA的功能也许会为肝细胞癌的患者提供有效治疗方案。E-cadherin常被认为可以抑制肝癌细胞的生长和转移，它不仅和基因突变、染色体不稳定性、DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA有关［7］，还有研究发现在其他肿瘤中E-cadherin的表达量与淋巴结累积情况、肿瘤分化程度显著相关［8］，E-cadherin的缺失往往被认为是EMT的标志之一。N-cadherin对大脑、心脏、骨骼肌、血管的发育和功能调节起着重要作用，同时N-cadherin的异常表达也与肿瘤细胞的凋亡、血管生成、侵袭和转移密切相关［9］。本研究中，实验结果显示在HepG2肝癌细胞中过表达microRNA-338-3p后，HepG2肝癌细胞的细胞划痕愈合率降低，侵袭实验中穿膜细胞数减少，上皮细胞标志物E-cadherin蛋白表达量上升，间质细胞标志物N-cadherin蛋白表达量下降。

综上所述，microRNA-338-3p可以抑制HepG2肝癌细胞的迁移、侵袭能力；microRNA-338-3p通过促进E-cadherin蛋白表达并抑制N-cadherin蛋白表达，从而抑制HepG2肝癌细胞的上皮间质转化，有望为肝细胞癌的临床治疗提供新思路。

参  考  文  献

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［4］   MIRZAEI S， ZARRABI A， ASNAF S E， et al. The role of microRNA-338-3p in cancer：growth，invasion，chemoresistance，and mediators［J］. Life Sci，2021，268：119005.

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（收稿日期：2023-03-11  修回日期：2023-10-22）

（編辑：潘明志）