双蛋白对大鼠骨密度的影响

闫文杰，松伟，韩迪，李琥，冯朵，王靖*

（1.农业农村部食物与营养发展研究所,北京 100081；2.北京联合大学生物化学工程学院,北京 100023）

骨密度改变是导致骨质疏松的直接原因,而骨吸收速率大于骨生成速率是骨密度下降的主要原因[1]。据推测2050 年约有4.49 亿老年人,老龄化达37.3%[2]。我国中老年人跌倒、骨折的发生率接近20%,并且女性高于男性[3]。四川省骨科医院调查了1 043 名60 岁以上人群的骨骼健康状况,发现骨质疏松患者中女性患者（25%）比例高于男性患者（17.75%）[4]。河北省保定、石家庄、承德三市对6 195 名20～80 岁常住居民进行了骨密度检测,结果表明女性患病率为1.72%,而男性患病率为0.99%。50 岁后是骨质疏松的高发时期[5]。朱洁云等[6]对68 932 例研究对象进行Meta 分析,中国60 岁以上骨质疏松患病率为37.7%。男性是27.3%,女性是48.4%。女性骨密度下降主要集中于50 岁后,体内激素水平发生改变,且绝经后患病率要明显高于未绝经女性[7-9]。因此相较而言,解决女性骨质疏松问题更加地迫切、重要。

已有试验证实,乳清蛋白及其水解肽二者均具有改善骨质疏松、增加骨骼密度的效果,可增加斑马鱼的骨密度及头骨矿化量[10]。乳清蛋白肽含有类似酪蛋白磷酸肽成分,能够促进小鼠钙的吸收,增加骨密度。补充乳清蛋白可减少老年骨质流失[11],增加雌性大鼠骨骼矿物质含量及骨密度,并且能够增加骨骼的承载能力。大豆分离蛋白可增加维甲酸所致骨质疏松模型小鼠子宫指数、增加骨质量及骨钙含量[12]、改善更年期骨密度下降等情况[13]。另有研究表明,日常营养素的摄入与老年人身体健康状况的相关性极高,特别是蛋白质类物质,高蛋白的摄入可显著改善老年人身体衰弱的情况,因此认为蛋白的摄入与老年人身体健康状况呈正相关[14-15]。本次实验以去除卵巢的方法建立骨质疏松模型,该模型可造成雌鼠激素水平降低,与中年女性骨质疏松、骨密度下降病理类似,从而使得实验结果准确性、可靠性更强,更加贴近中老年女性骨质疏松人群。

在此之前,乳清蛋白与大豆蛋白单一蛋白及其水解产物对骨密度影响已有考察,结果显示单一蛋白起效剂量较大,有文献表明给予10%乳清蛋白肽可提高大鼠骨密度[16],而30%的高蛋白大豆或牛奶的摄入可改善雌鼠骨骼形条[17]。在正式实验之前已做预实验对单一蛋白和双蛋白效果进行对比。结果表明5 g/kg的乳清蛋白或大豆蛋白对大鼠骨密度并无改善效果,5 g/kg 双蛋白也无明显改善效果。故本次实验不再设立单一蛋白对照组及双蛋白浓度梯度,仅设立双蛋白10 g/kg 一个剂量组,大豆蛋白与乳清蛋白质量比为1∶1。观察该剂量下双蛋白对雌性大鼠骨密度的影响,并考察两者结合是否可降低起效剂量,以期为后续双蛋白改善骨密度相关产品研发提供依据及一定的数据支持。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

BS2202S 电子天平:德国赛多利斯集团；Zeenit700P 原子吸收分光光度计:德国耶拿分析仪器股份公司；InAlyzer 双能X 射线骨密度仪:韩国Medikors 公司；DHG9140A 电热鼓风干燥箱:上海精宏实验设备有限公司。

钙标准液（1 000 mg/L）:国家有色金属及电子材料分析测试中心；硝酸（优级纯）:北京化工厂；高氯酸（优级纯）:天津市鑫源化工有限公司；氯化镧（优级纯）:上海麦克林生化科技股份有限公司；苯甲酸雌二醇（分析纯）:上海易恩化学技术有限公司；戊巴比妥钠（分析纯）:国药集团化学试剂有限公司；双蛋白固体饮料（由乳清蛋白、大豆分离蛋白、抗性糊精、碳酸钙等复配而成,乳清蛋白与大豆分离蛋白质量比为1∶1,钙含量5.2 g/100 g,蛋白质含量60 g/100 g,人体推荐剂量20 g/d）:农业农村部食物与营养发展研究所自制。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物

50 只无特定病原体（specific pathogen free,SPF）级雌性SD 大鼠,体质量在285～300 g,购于北京华阜康生物科技股份有限公司[SCXK（京）2019-0008],养于北京联合大学应用文理学院保健食品功能检测中心动物室[SYXK（京）2017-0038]。

1.2.2 模型建立

造模方法参考文献[18-19],动物适应性饲养一周后,戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉,剂量为30 mg/kg。距阴道口3～4 cm 处去毛,碘酒、酒精消毒后,切开皮肤,找到子宫,夹住卵巢,丝线结扎输卵管,剪除卵巢并检查剪除是否完全。顺势将子宫送回腹腔,肌肉与皮肤分层缝合后肌肉注射青霉素2 万U。假手术组操作与模型组一致,但不剪除卵巢,缝合肌肉及皮肤。

手术5 d 后,进行检查,方法为阴道涂片,滴管插入雌鼠阴道,冲洗数次后吸出涂片,观察是否有半透明、扁平的表皮细胞。连续检查7 d,若出现动情反应,表明手术失败。

1.2.3 实验分组

实验设假手术组、模型组、双蛋白组[10.00 g/kg 体质量（body weight,BW）,相当人用推荐量30 倍]、碳酸钙对照组（碳酸钙1.30 g/kg BW,含钙量均为0.52 g/kg BW,与双蛋白组相同）和阳性对照组。

阳性对照组:本次实验阳性物选择苯甲酸雌二醇[20]。具体操作方法为手术后第4 周,肌肉注射苯甲酸雌二醇0.2 mg/kg,每3 d 注射1 次。

双蛋白受试物配制方法:称取25.00 g 双蛋白样品加无菌水至50.0 mL,充分搅拌均匀；受试物按需求每日现用现配。双蛋白10 g/kg BW,连续灌胃90 d。

碳酸钙对照组受试物:称取6.50 g 碳酸钙研磨后加无菌水至100.0 mL,其他组均给予等量无菌水。灌胃体积为20 mL/kg BW,连续灌胃90 d。

1.2.4 样品处理与测定方法

实验结束后处死动物,剥离肌肉与组织取出右侧股骨,将股骨置于鼓风干燥箱中105 ℃烘干至恒重。称股骨干重,置于三角瓶中进行消化。

根据样品中钙含量范围,准确称取0.300～1.000 g股骨置于三角瓶中,加入硝酸与高氯酸体积比为4∶1制备而成的混合酸。加入15～20 mL 混合酸,置于加热板上加热消化,若混合酸剂量不足可再添加。消化至透明无色后加入去离子水,加热煮沸去除多余混合酸,该操作重复两次,最后剩余消化液体积不超过1 mL。消化样品同时进行空白试验对照,加入与样品相同体积的混合酸,在相同条件下进行相同操作。

样品消化结束后用原子吸收分光光度计测定股骨钙含量,密度仪测定骨密度,并根据股骨干重与骨含量计算股骨的骨钙含量,计算公式如下。

X=N/M

式中:X为骨钙含量,mg/g；N为钙含量,mg；M为股骨干重,g。

1.3 统计方法

用SPSS 软件进行数据处理。数据结果分为两部分,即方差齐性检验和关于均值相等的t检验。当方差齐次检验结果显著性（significance,Sig）>0.05 认为方差齐,故取均值相等t检验第一栏的Sig 值,当Sig≤0.05 认为两组间统计结果有差别；当方差齐次检验结果Sig≤0.05,认为方差不齐,取第二栏的Sig 值。数据以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 骨密度模型建立

在正式实验开始之前,先做预实验确定模型建立方法是否可成功制备骨密度降低模型。参照上述模型制备方法,按体质量分为假手术组与模型组,每组12 只动物,饲喂实验专用低钙饲料。饲养30 d 后处死动物,测定骨钙含量及骨密度,结果见表1。

表1 大鼠骨钙含量及骨密度Table 1 Bone calcium content and bone mineral density in rats

由表1 可见,与假手术组比,模型组骨钙含量显著下降（P<0.05）,股骨中点及远心端骨密度极显著降低（P<0.01）。表明本次实验所选择的去除卵巢方法可成功建立骨密度降低模型。

2.2 双蛋白对大鼠体质量的影响

实验期间每周对动物进行两次称重,观察双蛋白受试物及阳性物对动物体质量的影响,结果见表2。

由表2 可见,各组与假手术组比较,实验起始到结束各组动物体质量无显著差异（P>0.05）；第4 周假手术组体质量低于其他组,除碳酸钙对照组,其余各组体质量与假手术组比有显著差异（P<0.05）,实验末期假手术组体质量明显低于其余各组,与假手术组比各组体质量极显著增加（P<0.01）。结果表明实验期间给予双蛋白对大鼠体质量无影响。

除假手术组外各组体质量无明显差异。由此可知体质量变化原因应与去除卵巢手术有关。推测是卵巢剪除后导致动物体雌激素紊乱,从而影响日常摄食量及体内代谢水平,相关文献亦有证实雌激素水平变化可导致机体体质量变化及体内代谢水平改变,结论与实验结果一致[21-22]。

2.3 双蛋白对大鼠骨钙含量影响

双蛋白对大鼠骨钙含量的影响见表3。

表3 双蛋白对大鼠骨钙含量的影响Table 3 Effect of dual-protein on bone calcium content in rats

由表3 可见,与假手术组比,模型组骨钙含量显著下降（P<0.05）；与模型组比,阳性对照组骨钙含量极显著上升（P<0.01）；双蛋白组与碳酸钙对照组骨钙含量无显著变化（P>0.05）。结果表明双蛋白对骨钙含量无影响,推测双蛋白改善骨密度机制与其中的钙含量无关。

碳酸钙对照组与双蛋白组钙含量一致,但二者对骨钙含量有一定影响,且作用水平近似,但与模型组未产生差异,由此可知双蛋白对骨钙含量影响较小。研究表明碳酸钙可增加雄性动物骨密度,因此推测双蛋白对骨钙含量无影响可能因为实验选择了雌性动物,且进行了剪除卵巢手术。有文献表明女性在绝经后血清中25 羟维生素D3水平有所降低[23-24],同时发现雌激素可提高该物质含量,因此推测雌激素水平与维生素D 含量之间存在关联[25]。产生本次实验结果可能原因是造模后大鼠体内物质水平也发生改变,即使有外源钙摄入也无法进行吸收及沉积。后续作用机理研究可进一步对该现象进行深入探讨。

2.4 双蛋白对大鼠骨密度影响

双蛋白对大鼠股骨中点及远心端骨密度的影响见表4。

表4 双蛋白对大鼠股骨中点及远心端骨密度的影响Table 4 Effect of dual-protein on bone mineral density at midpoint and distal end of femur in rats

由表4 可见,与模型组比较,双蛋白组大鼠股骨中点骨密度显著升高（P<0.05）,远心端骨密度极显著升高（P<0.01）,阳性对照组股骨中点骨密度及远心端骨密度均极显著升高（P<0.01）,碳酸钙对照组远心端骨密度极显著升高（P<0.01）,对股骨中点骨密度无显著影响。结果表明双蛋白组有改善骨密度的效果,且增强远心端骨密度效果优于中点骨密度。

2.5 股骨大体观察及骨密度成像

双蛋白对股骨颜色、骨质、脆度影响见图1。

图1 股骨大体观察Fig.1 Macroscopic observation of femur

由图1 可知,股骨观察发现假手术组股骨颜色呈现白色,骨质正常,脆度正常不易折断。模型组可观察到股骨颜色加深呈现棕褐色,骨质酥脆,脆度低易折断。双蛋白组颜色呈白色,接近假手术组,骨质正常,脆度正常。阳性对照组颜色呈白色,骨质正常,脆度正常,与假手术组接近。碳酸钙对照组股骨颜色略呈棕褐色,较模型组有一定改善,骨质略酥脆,脆度优于模型组。结果表明阳性物及双蛋白对股骨有明显改善作用,且变化明显肉眼可见。碳酸钙对照组颜色变化明显,骨质、脆度也有所改善,但效果不如双蛋白及阳性对照组。由此可知双蛋白可起到改善骨密度的效果。

双蛋白对股骨成像影响见图2。

图2 股骨成像Fig.2 Femur imaging

成像系统可通过颜色观察股骨密度情况,颜色越深表明密度越大,颜色越浅表明密度越小。由图2 可知,通过成像系统观察发现,模型组股骨颜色略浅呈灰白色,正常股骨颜色较深呈灰黑色。阳性对照组及双蛋白组颜色接近于正常股骨,碳酸钙对照组无明显变化。结果表明阳性物及双蛋白对股骨密度有改善作用,而同等剂量碳酸钙无明显效果。由此可知双蛋白可增强骨密度,且与所含有的钙含量无关。

3 讨论与结论

通过本次实验结果可以得出10 g/kg 双蛋白固体饮料可提高模型大鼠的骨密度,对于骨钙含量并无影响,且该剂量双蛋白对应的单一蛋白剂量为3 g/kg,低于预实验使用剂量,单独使用单一蛋白5 g/kg 未见改善,乳清蛋白与大豆分离蛋白各3 g/kg 结合的双蛋白对骨密度有显著改善效果,表明二者结合有一定的协同作用。对于股骨状态的改善效果肉眼可见,与模型组差异显著,与阳性对照组无明显差别。并且碳酸钙对照组对于骨钙含量也无明显影响,表明本次实验中双蛋白起效物质与钙含量关系不密切,这可能与所选择的剪除卵巢模型有关。有研究表明,妇女绝经后骨量每年都在流失,且流失速率较为稳定,约为每年1%。雌激素水平下降后,骨吸收速率增加,骨生成小于骨吸收,从而打破了骨转换速率,导致了骨质疏松的形成。

本次实验选择的阳性物为苯甲酸雌二醇,是雌激素类药物,临床上常用于补充雌激素水平,同时还可增加钙元素在骨骼中沉积。临床试验也证实苯甲酸雌二醇能够增加卵巢早衰患者骨密度,并且无严重不良反应。故本实验选用苯甲酸雌二醇为阳性物,实验结果也表明其可显著增加模型大鼠骨钙含量及骨密度,对实验期间动物体质量并无影响。另有研究表明大豆异黄酮对于雌性大鼠骨密度有促进作用。但本次实验中起效物质是大豆分离蛋白,还是大豆异黄酮,有待后续进一步的研究。

绝经后妇女体内多种因子水平发生改变,骨质疏松患者骨桥蛋白水平升高,甲状腺激素降低,I 型前胶原氨基端前肽升高。目前改善骨密度的产品及药物研发逐渐趋向天然活性成分及药物。例如中药骨碎补可通过PI3K-Akt、HIF-1 等信号通路改善绝经后骨质疏松。中成药当归补血汤则通过调节Wnt/β-catenin 信号通路调节骨密度水平。乳铁蛋白可提高胰岛素样生长因子结合蛋白5 水平,降低胰岛素样生长因子结合蛋白3 水平,起到改善骨密度作用。本次实验所选择样品原料主要为乳清蛋白与大豆蛋白,二者均源于日常的食物之中,不仅是日常所需的营养物质同时也是天然的活性成分。目前双蛋白改善骨密度的机制尚不明确,进一步研究空间较大,而且双蛋白作为天然产物制备提取而来,安全稳定,具有广泛的应用前景。