网络药理学结合分子对接技术揭示芹菜籽抑制痛风的潜在分子机制

李镁娟

张 军2

张云数2

李乾伟2

张 娜2

刘梦娇2

张人平2

(1. 河南国德标检测技术有限公司,河南 郑州 451100;2. 郑州工程技术学院化学与食品工程学院,河南 郑州 450044)

近年来,随着物质生活水平的日益提高和生活方式的改变等因素的影响,代谢性疾病已经成为全球亚健康状态的主要原因[1]。代谢性疾病是指因生物体自身代谢引起的疾病,包括代谢减少或合成旺盛等,包括糖尿病、血糖紊乱症、高尿酸症等[2],高尿酸症已成为继高血糖、高血压、高血脂后的“第四高”[3]。高尿酸症可以引起高血压[4]和一系列血管疾病[5],更是痛风形成的直接诱因[6]。痛风是人体嘌呤合成代谢增加,尿酸产生过多或排泄不畅而致血中尿酸浓度升高,尿酸盐呈针状结晶沉积在关节滑膜、肾脏及其他组织中引起的一种代谢炎性疾病[7]。痛风在一般人群中的患病率为1%～4%,男性比女性患病风险多2～6倍,全球痛风发病率仍有增加之势[8]。痛风常用药物秋水仙碱、别嘌呤醇、非布司他等都有一定的副作用而不能长期使用[9]。因此,寻找无副作用的药物,或开发新的治疗方法成为解决痛风等代谢性疾病的关键。

Downer等[10]认为,代谢引起的疾病最好用饮食方法来解决,即“食品就是药品”。中国自古就有“药食同源”之说,用食物治疗或减轻疾病是中国中医药最伟大的思想之一[11-12]。芹菜(ApiumgraveolensL.)是二年或多年生草本类植物,香气浓郁,是深受消费者喜爱的菜蔬之一,自古就有芹菜籽(种子)作为调料食用或中药使用。实践[13-15]表明,芹菜籽对抑制痛风的发生,缓解症状有一定效果,但芹菜籽对痛风的抑制机理仍不清晰。

随着生物信息学和系统生物学的快速发展,网络药理学方法已被完美地用于寻找关键靶点及其潜在的分子机制[16]。基于“药物—疾病—靶点”相互作用网络的网络药理学,全面、系统地评价药物对疾病的干预效果,符合中医学的特点;分子对接是一种重要的计算机辅助药物发现方法,可用于预测药物成分与靶蛋白之间的相互作用,以及药物可能的结合位点[17],这为药物发现或疾病治疗机理提供了重要思路和方法。研究使用网络药理学预测芹菜籽治疗痛风的潜在机理、用分子对接技术验证分子机制,为治疗或预防痛风开发新药提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 芹菜籽关键成分筛选及靶点基因提取

从已有能查到文献[14-15,18-19]中筛选芹菜籽的成分共计74种,再使用化源网(https://www.chemsrc.com)查询其CAS号,使用中药系统药理学分析平台数据库(https://www.tcmsp-e.com,TCMSP)以查找CAS号的方式来查找芹菜籽的关键成分,并且以类药性(DL)≥0.10,口服生物利用度(OB)≥20%为筛选条件,筛选出具有药物性质且人类肠道易于吸收的成分,经由TCMSP数据库筛选得芹菜籽核心活性分子作用靶点;借助UniProt资料库(http://www.uniprot.org)查询并确立相应靶蛋白归属的规范化基因名,经过去除冗余后,精准锁定芹菜籽主要成分的靶向基因。

1.2 痛风疾病相关靶点的搜集

检索孟德尔人类遗传学数据库(https://omim.org/,OMIM)和人类基因数据库(https://www.genecards.org,GeneCards),搜索“gout”,删除重复项,获得痛风疾病所有的靶点基因。将芹菜籽的关键成分的靶点基因与痛风疾病的靶点基因导入https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/网站绘制韦恩图,获得芹菜籽与痛风的交集靶点基因以及数量。

1.3 芹菜籽活性成分—痛风靶点网络构建及可视化分析

通过Cytoscape 3.9.0软件收集芹菜籽活性物质与痛风相关基因的数据,构筑了一幅涵盖“分子—疾病靶点”复杂网络图。随后,运用该软件的Network Analyzer工具,对图中的多个节点进行了精确的拓扑属性评估。特别关注的是节点的中介中心性(BC)、紧密中心性(CC)以及度中心性(DC)三项指标。它们的平均值超过特定阈值的节点,即为在芹菜籽对痛风治疗中发挥核心作用的关键活性成分。

1.4 蛋白互作网络(PPI网络)的构建

输入芹菜籽与痛风相关基因的交互数据,转至String数据库(https://www.string-db.org),选择“Multiple proteins”作为搜索维度,将种属锁定为“Homo sapiens”,并设定置信度阈值不低于0.9。为清晰可视化,屏蔽掉所有断裂节点,之后将信息以tsv格式导出。并将该文件纳入Cytoscape 3.9.0软件中,借助CytoNCA插件进行深入的网络拓扑分析。通过综合比较6个核心参数——中介中心性、紧密中心性、度中心性、特征向量中心性(EC)、局部边连通性(LAC)以及网络中心性(NC)的平均值,从中筛选出具有代表性的网络关键节点,即为核心靶向基因。

1.5 GO功能和 KEGG通路富集分析

采用 DAVID 6.8 数据库(https://david.ncifcrf.gov/),对芹菜籽潜在治疗痛风靶点进行GO功能分析,以了解靶点的生物学过程,KEGG通路分析研究药物靶点主要信号通路,DAVID平台列表与背景均设置为“Homo sapiens”,GO富集分析选择生物过程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)和细胞组成(cellular component,CC)3个模块,通路分析选择KEGG。将GO分析的BP、CC、MF通路分析的数据下载保存好,然后按照P值从小到大排序,KEGG通路富集分析靶点信号通路,以P<0.05为阈值,依据count值进行排序。再选取前20条信号通路对BP、CC、MF和KEGG通路分析的重要通路,使用微生信在线网(http://www.bioinformatics.com.cn/)作带颜色富集条形图进行可视化分析。

1.6 分子对接过程

利用软件Chemdraw画出筛选的芹菜籽成分的2D结构,再使用Chem3D软件将2D结构转换为3D结构,优化力学结构,使其结构处于稳定状态,从蛋白质数据库(PDB)中提取针对痛风疾病相关的靶蛋白的三维构象文件。通过PyMOL软件的精确操作,排除了水分子及非必要的小分子配体,仅留下纯净的受体蛋白结构并保存为标准的.pdb文件。随后,借助AutoDock 1.2.0软件对该蛋白受体进行精细化处理,包括加氢和调整分子的柔韧性。同时,对小分子配体也执行了加氢处理,并精确识别了配体的活性中心。经过一系列的预处理后,将蛋白受体与配体统一转换为.pdbqt格式,并利用Grid模块仔细设定对接盒子的参数,力求将其体积最小化以精准覆盖蛋白结构,确保空间定位的高效率和精确性。参数设置完毕后,保存配置,并运用AutoDock软件进行配体与受体的分子对接工作,从而计算出结合能(BE)的分值。此过程不仅体现了对分子生物学深刻的理解,也展现了计算化学在药物设计中的实际应用。

2 结果与分析

2.1 芹菜籽关键成分的筛选结果

芹菜籽主要活性成分为黄酮化合物、烯萜类成分等。利用中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP)检索到芹菜籽主要活性成分除洋川芎内酯-N、洋川芎内酯-J、木栓酮、佛手苷内酯、β-芹子烯外均有对应靶点,总计375个,删除重复项,相关主要活性成分16种,对应202个活性成分靶点。芹菜籽主要活性成分信息见表1。

表1 芹菜籽的活性成分

由于TCMSP筛选有效成分多依据DL和OB,设置较高会使本来有效果的成分无法进行全面分析,因此,将OB≥20%,DL≥0.10[20],所得有效成分16种。

2.2 “芹菜籽成分—痛风靶点”筛选

通过GeneCards共获得芹菜籽核心成分的靶点基因共202个;使用OMIM database筛选痛风对应的靶点基因,删除重复项后共1 732个。其中芹菜籽与痛风疾病交集靶点基因合计69个,见图1。

图1 芹菜籽药效成分靶点与痛风相关靶点的韦恩图

2.3 “芹菜籽成分—痛风靶点”网络构建及可视化分析

利用Cytoscape 3.9.0软件建立药物——活性成分—靶点—疾病的可视化网络图,再利用Cytoscape 3.9.0软件的Analyze Network功能,对交集靶点基因进行评分(0～1分有38个基因,为一类评分;2～3分有22个基因,为二类评分;4～8分有9个基因,为三类评分),一类基因在最外层,二类基因放在第二层,三类基因放在最内层。在建立芹菜籽核心成分与痛风疾病的网络图时,发现芹菜籽有5个成分所对应的靶点基因与痛风疾病靶点基因没有联系,即这5个成分对治疗痛风疾病并没有效果,因此在绘制网络图时不纳入。通过评分得到10种关键成分,“芹菜籽成分—痛风靶点”网络详见图2。成分节点的大小表示与其相关的靶点基因数量多少,蓝色菱形越大表示与之相关联的基因数量越多,在网络中作用也就越明显。

菱形代表芹菜籽的关键成分,椭圆形代表“芹菜籽—痛风”交集靶点基因

使用Cytoscape 3.9.0软件的Network Analyer插件对上述网络中的蓝色药物节点进行拓扑分析得出,芹菜籽核心靶点网络节点平均BC值为0.217 5,平均CC值为0.456 7,平均DC值为13.6。其中只有槲皮素1种成分的BC值、CC值、DC值均大于芹菜籽核心靶点网络节点平均值(槲皮素BC 0.723 814 1,CC 0.685 185 19,DC 63),推测其可能是芹菜籽治疗痛风的重要成分。

2.4 PPI网络结果分析

将芹菜籽与痛风的交集基因导入String在线平台对69个潜在靶点进行PPI蛋白互作网络分析。如图3所示,网络中包含69个节点,115条边,平均节点度为3.33,平均局部聚类系数0.475。

图3 PPI网络与关键靶点

靶点连接的线越多,表明该靶点DC值越高,越是关键靶点,按照DC值≥10筛选条件[21],获得10个核心靶点基因,分别为丝裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)、肿瘤坏死因子(TNF)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、血小板衍生的生长因子受体β(PDGFRβ)、酪氨酸蛋白激酶(LYN)、白细胞介素-4(IL4)、酪氨酸蛋白激酶HCK(HCK)、白细胞介素-8(CXCL8)、整合素αV(ITGAV)、白细胞介素-2(IL2),以上10种靶点基因拓扑参数 BC、CC、DC、EC、LAC、NC皆大于各自均值121.033 02,0.148 69,7.392 86,0.085 02,2.216 19,3.122 07,详见表2。

表2 核心靶点基因拓扑参数

通过建立芹菜籽成分—痛风基因靶点网络,发现10个药物成分中,有5个成分与核心基因靶点密切相关,推测这5个药物成分是治疗痛风疾病的关键成分,即核心成分:槲皮素、芹菜素、木犀草素、柯伊利素、芹菜甲素,在网络中DC值分别是63,28,25,7,5,详细情况见图4。

图4 芹菜籽核心成分—痛风关键基因靶点网络

2.5 分子对接验证分析

将2.4得到的5个核心成分为配体与痛风关键基因TNF、MAPK14、IL4、CXCL8、LYN、PDGFRB、HCK、VEGFA、ITGA、IL2为受体进行分子对接进行验证。对接RMSD<0.2 nm,分子对接结合能见表3。如果分子对接结合能<0 kJ/mol时,表明小分子配体可以与蛋白受体结合;结合能<-17.7 kJ/mol,表明可以自发地结合;结合能<-29.3 kJ/mol,说明分子间具有很强的结合活性[22-23]。结合能越小,说明配体与蛋白之间亲和力越大,两者发生相互作用的可能性越高,进而发挥作用越大[24]。

表3 核心成分与靶点基因蛋白的分子对接结合能

由表3中数据可知,5个核心成分与痛风关键基因平均结合能<-17.7 kJ/mol,表明活性成分与核心靶点之间可以自由结合,槲皮素、芹菜素、木犀草素、柯伊利素与关键基因平均结合能<-29.3 kJ/mol,表明其与核心靶点之间有强烈的结合力。因此,认为分子对接预测结果真实可靠,PyMol软件可以对每个小分子配体与疾病靶点蛋白结合能最低的分子对接结果进行可视化调节,如图5所示。

图5 分子对接模式图

由对接结果可知氢键是促进芹菜籽主要成分和与痛风关键基因活性位点结合的主要作用力。即槲皮素-HCK结合的活性位点ALA-293、THR-338、MET-341形成3个氢键;芹菜素-HCK编码蛋白的活性位点THR-338、MET-341形成2个氢键;木犀草素-ITGAV的活性位点VAL-23、VAL-98、ARG-99、PHE-278、TYR-406形成5个氢键;柯伊利素-LYN的活性位点ASP-156、ILE-86、LYS-44、MET-91、GLU-89 形成5个氢键;芹菜甲素-HCK的活性位点THR-338形成1个氢键。从对接结果来看,配体—受体形成氢键越多,复合体系越稳定,对蛋白质的活性控制能力就越强[25-26]。因此,木犀草素、柯伊利素对痛风的抑制效果较强。

2.6 GO功能富集和KEGG信号通路分析

将获得的69个芹菜籽抗痛风的潜在靶点基因导入DAVID数据库,限定物种为“Homo Sapiens”,以P<0.05为筛选条件,进行GO功能富集和KEGG分析[27],结果如图6所示。GO富集得到463个条目,其中BP 349个,CC 39个,MF 75个。BP主要是细胞凋亡过程的负调控(negative regulation of apoptotic process)、正向调控细胞增殖(positive regulation of cell proliferation)、细胞迁移的正向调节(positive regulation of cell migration)等;CC主要是细胞外间隙(extracellular space)、胞外区(extracellular region)、细胞表面(cell surface)等;MF主要是酶结合(enzyme binding)、细胞因子活性(cytokine activity)、蛋白质同源二聚活性(protein homodimerization activity)等。

图6 GO功能富集分析

KEGG通路富集分析共得到1 225条目,以P<0.05为阈值,依据count值排序,选取前20条KEGG信号通路上的基因作为痛风治疗靶基因。由于研究的是芹菜籽抗痛风作用,因此在得到的前20条通路中去掉与之无关的通路,得到PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、流体剪切应力和动脉粥样硬化(fluid shearstress and atherosclerosis)、脂质和动脉粥样硬化(lipid and atherosclerosis)、MAPK信号通路(MAPK signaling pathway)、IL-17信号通路(IL-17 signaling pathway)等。按照打分排列前10的通路见表4。

表4 通过KEGG通路富集的前10条通路

3 结论

综上所述,研究应用网络药理学方法预测了芹菜籽药效成分及作用靶点,其中抑制或治疗痛风关键成分为槲皮素、芹菜素、木犀草素、柯伊利素和芹菜甲素,与痛风相关的靶点TNF、MAPK14、IL4、CXCL8、LYN、PDGFRβ、HCK、VEGFA、ITGA、IL2密切相关。使用分子对接技术将芹菜籽活性成分与关键靶点进行结合能力预测,发现槲皮素、芹菜素、木犀草素、柯伊利素、芹菜甲素与10种蛋白均具有良好的结合活性,结合能均小于-20.97 kJ/mol,验证了芹菜籽中多种有效成分通过作用于关键靶点起到防治痛风的作用,其中柯伊利素与10种关键靶点蛋白结合能最低,为-33.76 kJ/mol,表明具有强烈的结合活性。GO 功能富集分析表明芹菜籽具有调控细胞凋亡,影响炎症反应的作用。KEGG 富集分析发现,芹菜籽活性成分与痛风靶标之间相互作用的主要信号通路可能是PI3K-Akt信号通路、IL-17信号通路、MAPK信号通路、NF-κB信号通路等,表明芹菜籽通过多条通路作用于痛风的调控过程。