鸡毒支原体抗体间接ELISA检测技术的应用

果磊 关晓辉

第一作者简介：果磊（1985-），女，高级兽医师。研究方向为畜牧兽医。

*通信作者：关晓辉（1976-），男，畜牧师。研究方向为畜牧兽医。

DOI：10.19981/j.CN23-1581/G3.2024.13.016

摘  要：该文主要探究ELISA检测试剂盒在鸡毒支原体检测中的应用。使用血清样品、鸡毒支原体菌株和SPF鸡等作为实验材料，分别进行灵敏性实验、重复性实验、抗体持续期检测、临床样品检测准确性检测和保存期实验。结果表明，ELISA试剂盒的灵敏性较好；重复性实验的稳定性达到预期；鸡在接种弱毒性疫苗后的35 d内，血清中抗体水平有明显上升；临床样品检测准确性较高；在保存期320 d内，ELISA试剂盒内试剂的敏感性和特异性良好。分析可得，使用ELISA试剂盒测试血清中的鸡毒支原体是可行的，并且具有操作简便、成本较低、效率较快的优势。

关键词：鸡毒支原体；ELISA检测；灵敏性试验；重复性实验；抗体持续期监测

中图分类号：S858.31       文献标志码：A          文章编号：2095-2945（2024）13-0064-04

Abstract： This paper mainly explores the application of ELISA detection kit in the detection of Mycoplasma gallisepticum. Using serum samples， Mycoplasma gallisepticum strain and SPF chicken as experimental materials， sensitivity test， repeatability test， antibody duration test， clinical sample detection accuracy test and preservation period test were carried out respectively. The results showed that the sensitivity of ELISA kit was good， the stability of repetitive test was as expected， the antibody level in serum of chickens increased significantly within 35 days after inoculation with weak toxicity vaccine， the detection accuracy of clinical samples was high， and the sensitivity and specificity of ELISA kit were good within 320 days. According to the analysis， it is feasible to use ELISA kit to detect Mycoplasma gallisepticum in serum， and it has the advantages of simple operation， low cost and high efficiency.

Keywords： Mycoplasma gallisepticum; ELISA detection; sensitivity test; repetitive test; antibody duration monitoring Mycoplasma gallisepticum

鸡毒支原体（MG）主要攻击鸡的呼吸道系统，感染后的鸡表现出咳嗽、鼻炎、气管啰音等症状，严重时还会出现肺水肿，随着病情发展可能会窒息死亡。由于鸡毒支原体具有很强的传感性，如果发现不及时、治疗不到位，会给养殖户造成巨大损失。现阶段，酶联免疫吸附实验（ELISA）是检测鸡毒支原体的一种常用方法，但是操作较为繁琐、技术成本较高。在此基础上设计的ELISA试剂盒，则具有使用方便、成本较低的特点，适合广大养殖户进行鸡毒支原体的检测。

1  材料

1.1  试剂盒

选用美国IDEXX公司生产的ELISA试剂盒。

1.2  血清样品

选用中国兽医药品监察所提供的鸡毒支原体抗体标准阳性血清（50份）和标准阴性血清（100份）。另外从本地养殖场采集200份临场鸡血清样品，其中60份为自然感染鸡的血清，140份为疫苗免疫鸡的血清。

1.3  鸡毒支原体培养基

按照以下方法准备A、B 2种溶液：精准量取20 ml的氯化钠，15 ml的氯化钾，0.8 ml的硫酸镁，0.5 ml的氯化鎂，以及0.5 ml的氯化钙，将上述5种化学药剂混合后，倒入容量瓶中，加入去离子水定容至500 ml，充分摇匀，得到A液。精准量取0.5 ml磷酸氢钠，0.35 ml磷酸氢钾，以及5 ml葡萄糖，倒入容量瓶中，加入去离子水定容至500 ml，充分摇匀，得到B液。

量取30 ml水解乳蛋白，6 ml葡萄糖，20 g丙酮酸钠和38 g牛心浸汁，将上述4种材料混合后，各加入100 ml的A液与B液。使用玻璃棒搅拌使其均匀混合后，转移到容量瓶中。加入去离子水定容至2 000 ml。观察到各类物质充分溶解后，再滴加0.5%酚红。测量此时混合液的pH，然后使用盐酸或氢氧化钠进行中和，使混合液的pH维持在7.0～7.5之间，过滤后放置在0～5 ℃环境下保存备用。

1.4  菌株

使用中国兽医药品监察所提供的鸡毒支原体R株作为菌株。

1.5  实验动物

从某兽医研究所挑选30只健康的30日龄SPF（无特定病原）鸡，采集鸡血清进行实验室检验，确定为阴性。另外，挑选8只疑似鸡毒支原体感染的病鸡送检。

2  方法

2.1  灵敏性实验

用PBS（磷酸缓冲盐）溶液将鸡毒支原体的阳性血清按照1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200和1∶6 400的比例进行稀释，然后使用ELISA试剂盒对每个稀释度进行测定。为了消除误差，每个稀释度测定次数为3次，取平均值。设置鸡毒支原体的阳性和阴性对照，计算待检测血清的S/P值，计算公式如下

S/P=（OD样品-OD阴性对照）/（OD阳性对照-OD阴性对照），

式中：OD表示吸光度。

2.2  重复性实验

进行批内和批间2个重复性实验。批内重复性实验方法为：采用血清学检测，挑选3份为鸡毒支原体阳性的血清和3份鸡毒支原体阴性的血清，使用ELISA试剂盒检测同一批次的ELISA板，每份血清样品需要重复检测3次以消除误差，统计结果[1]。批间重复性实验与上述方法类似，区别在于使用不同批次的ELISA板测定血清样品。

2.3  抗体持续期检测

采用活体疫苗注射的方式，选择经过毒性弱化处理的鸡毒支原体疫苗给5只30日龄的SPF鸡接种，另外1只不做免疫处理，用于对照。然后使用ELISA试剂盒分别测试免疫前（0 d）、免疫7天后（7 d）、免疫14天后（14 d）、免疫21天后（21 d）、免疫28后（28 d）和免疫35天后（35 d），血清中抗体的水平，并计算S/P值，观察抗体随时间推移的产生规律。

2.4  临床样品检测准确性

为了进一步确定ELISA试剂盒在测定鸡毒支原体方面的准确性，对8只疑似感染鸡毒支原体的病鸡进行剖检，并观察其临床症状和病理表现。同时，分别从鸡的肺部、气囊处采集样品，进行分离培养和PCR检测，与ELISA试剂盒的测定结果进行对照，判断测定结果的一致性[2]。

2.5  保存期实验

将ELISA试剂盒放置于冰箱中，温度在0～5 ℃，并做如下实验：①保存期试剂的性状检测，分别在试剂放入冰箱前（0 d）和保存60、120、180和240 d，观察ELISA试剂盒中试剂的性状。②保存期灵敏性检测，选用鸡毒支原体阳性对照血清，使用PBS缓冲液按照1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200和1∶6 400的比例进行稀释，分别在试剂放入冰箱前（0d）和保存60、120、180和240 d后，使用ELISA试剂盒对稀释后的血清进行检测。③保存期特异性检测。选择鸡源性其他常见的7种阳性血清样品（MS、ILTV、IBV、NDV、H5、H7和H9），分别使用保存了0、60、120、180和240 d的ELISA试剂盒进行测试[3]。

3  结果

3.1  灵敏性实验结果

使用ELISA试剂盒对50份已经确定的鸡毒支原体阳性血清进行检测，检测出阳性血清49份，阴性血清1份，ELISA检测技术的敏感性为49/50×100%=98%，敏感性较好。使用该检测技术对8个稀释度的血清进行检测，得出OD650nm（被测溶液在650 nm波长处的吸光度），并根据S/P计算公式将其转化为相应S/P值，统计结果见表1。

由表1数据可知，随着血清稀释度的增加，吸光度和S/P值逐渐降低。当血清稀释度达到1∶1 600时，S/P值仍然大于0.4，表明ELISA检测技术测定鸡毒支原体的灵敏性較好。

3.2  重复性实验结果

在批内重复性实验中，使用同一批次的ELISA板分别测定6种血清，测定结果的变异系数在1.5%～5.0%之间，说明ELISA检测试剂盒的稳定性较好。在批间重复性实验中，使用6个批次的ELISA板检测分别检测6种血清，测定结果见表2。

表1  灵敏性实验结果

表2  批间重复性实验结果

由表2数据可知，在批间重复性实验中，变异系数在2.7%～5.7%之间，虽然相比于批内重复性实验的稳定性较差，但是总体上仍然远低于10%，表明ELISA检测试剂盒的稳定性达到预期。

3.3  抗体持续期检测结果

在免疫前（0 d）、免疫后7、14、21、28和35 d这6个时间点，分别采集鸡的血清，并使用ELISA试剂盒测试抗体的OD650 nm值，按照上文处理方式在OD650 nm值和S/P值之间进行换算。鸡毒支原体抗体活疫苗免疫前后试剂盒检测的抗体水平如图1所示。

图1  鸡毒支原体抗体活疫苗免疫前后试剂盒检测的抗体水平

观察图中鸡毒支原体抗体水平在0～35 d内的变化趋势可以发现，注射过毒性弱化处理的鸡毒支原体疫苗的5只30日龄SPF鸡，在疫苗接种后的35 d内，血清中抗体水平有了明显上升，其中2号样品的抗体水平（S/P值）最高，在35 d时达到了5.80。相比之下，没有注射疫苗的鸡，在整个实验期间血清中抗体水平基本没有变化[4]。通过对照可以得出，SPF鸡通过接种弱毒性的鸡毒支原体抗体疫苗，能够在一定时间内使血清中的抗体水平得到升高，从而提高了对该病的抵抗力。横向对比可以发现，5只注射了弱毒性鸡毒支原体疫苗的SPF鸡，最早在免疫接种的7 d后可以在血清中检测到相应的抗体，并且随着时间的推移，血清中抗体的水平也呈现出不同程度的增长。

3.4  临床样品检测准确性结果

对8只疑似感染鸡毒支原体的患病鸡进行一段时间的观察，记录其临床症状；然后对病死鸡进行剖检，进一步观察机体的病理变化，统计结果见表3。

表3  临床样品检测准确性结果

由表3信息可知，8只患病鸡均表现出呼吸道异常，其中6例均出现了气囊浑浊的情况，2例出现了肺内有黄色异物的情况，2例出现了肺内有渗出液的情況；另外，患病鸡还表现出精神不振、形体消瘦、眼睑红肿甚至是失明的临床症状。从病死鸡的肺部、气囊取样，进行分离培养和PCR检测、ELISA检测，横向对比结果可以发现，8只病死鸡中PCR检测结果全部为“阳性”，分离培养结果有7例为“阳性”，ELISA试剂盒检测有5例为“阳性”。ELISA试剂盒与分离培养结果一致的有4例。这一数据表明，选择ELISA试剂盒进行样品的血清检测，准确性略低于PCR检测和分离培养。但是分离培养所需周期较长，培养周期通常在3天甚至更长，检测效率不高；而PCR检测的难度较高、操作不便，对技术有严格要求。相比之下，ELISA试剂盒测定则具有操作简便、效率更快等优势，因此仍然可以作为鸡毒支原体检测的优选方法[5]。

3.5  保存期实验结果

在保存期试剂的性状检测方面，分别观察并对照了ELISA试剂盒内各试剂在0、60、120、180和240 d的性状。结果表明，试剂均为澄清、透明状，内部没有肉眼可见的异物，说明在长达240 d的保存期内，ELISA试剂盒的试剂保存情况良好。在保存期的敏感性检测方面，把阳性血清进行不同倍数的稀释后，分别在0、60、120、180和240 d，使用ELISA试剂盒进行血清检测，统计结果见表4。

由表4数据可知，对于相同稀释倍数下的血清，在不同保存时间后使用ELISA试剂盒进行检测，测定结果虽然存在一定差异，但是整体上比较稳定。以稀释倍数为1∶1 600为例，变异系数（CV）为7.01%，说明在0～240 d内，ELISA试剂盒的检测结果一致性较好。总体来看，使用保存240 d的ELISA试剂盒测试不同稀释倍数下的血清，检测结果的变异系数在2.57%～8.54%之间，未超过10%，说明ELISA试剂盒在保存期内的敏感性较好。

使用保存时间分别为0、60、120、180和240 d的ELISA试剂盒，对鸡源性其他呼吸道疾病的阳性血清进行检测，结果见表5。

根据表5数据可知，对于不同保存期内的同一种疾病的阳性血清，检测结果的变异系数在2.47%～8.40%之间，同样未超过10%。说明在320 d内ELISA试剂盒的特异性未发生明显变化。

4  结束语

随着规模化养殖场的普及，养殖户需要做好鸡常见疾病的检测和防治，才能避免疫病的大规模扩散，进而提高养殖经济收益。使用ELISA试剂盒检测鸡毒支原体，具有检出限低、操作方便的优势，并且ELISA试剂盒可长时间保存，养殖户可使用ELISA试剂盒自行测试鸡是否感染鸡毒支原体，为疫病的防控提供了技术支持。

参考文献：

[1] 贾妙妙，王国康，李丽.基于新城疫病毒NP蛋白的间接ELISA抗体检测方法的建立[J].中国兽医学报，2021，41（3）：11-12.

[2] 张承新，李玉燕，张鹏.鸡毒支原体MG荧光定量PCR技术评估实验室MG核酸污染方法[J].家禽科学，2022（3）：60-62.

[3] 黄小洁，吴华伟，张兵.鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）抗体间接ELISA检测方法的建立[J].中国兽药杂志，2022，56（9）：14-21.

[4] 程旭，周生，唐梦君.基于鸡传染性支气管炎病毒Vero细胞适应株全病毒抗原的间接ELISA抗体检测方法的建立[J].中国家禽，2022，44（5）：44-45.

[5] 唐金文，陈基明，吕迪.基于禽偏肺病毒N蛋白的间接ELISA检测方法的建立和初步应用[J].中国兽医科学，2021，55（7）：814-820.