化橘红微生物限度检查方法适用性研究

叶宝玉 黄妹齐 陈日檬* 纪小莉 李 蔚

化橘红又名“化州橘红”，系广东道地药材。其中芸香科植物化州柚Citrusgrandis‘Tomentosa’习称“毛橘红”；柚Citrusgrandis(L.) Osbeck的未成熟或近成熟的干燥外层果皮习称“光七爪”“光五爪”[1]。化橘红性温，味辛、苦，含有多糖、黄酮、香豆素、挥发油等成分[2-3]，具有散寒、燥湿、利气、消痰功效，用于风寒咳嗽、喉痒痰多、食积伤酒、呕恶痞闷等[4-5]。其富含多种活性成分，动物实验证明具有显著的抗炎、抗氧化、免疫调节等作用，可用于防治糖尿病、心肌损伤[6-7]。

化橘红为名贵中药，目前有针对其本草学[8]、化学成分[9]、药理作用[10]和临床试验[11]等的研究，但缺少对化橘红微生物限度的相关研究。本研究通过对化橘红微生物限度检查法进行方法学验证，并对其进行微生物安全风险评估，制定有针对性的质量控制标准，规范生产的各个环节，使微生物负荷降低，减少化橘红的用药安全风险，促进其作为广东道地药材的健康发展。

1 仪器与样品

1.1 仪器

洁净工作台（SW-CJ-2FD，苏州安泰空气技术有限公司），电子天平（MP500B，上海恒平科学仪器有限公司），热空气消毒箱（GR-246，上海博迅实业有限公司），高压灭菌器（GF88DX，致微厦门仪器有限公司），电热恒温培养箱（DHP-9082B，上海一恒温培养箱），霉菌培养箱（HMJ-Ⅲ-250，上海跃进医疗器械有限公司），生化培养箱（HPX-Ⅱ-250，上海跃进医疗器械有限公司），移液器（Thermo Scientific）。

1.2 菌种

本研究所用菌株均为第3代。铜绿假单胞菌[CMCC(B)10104]、金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、乙型副伤寒沙门氏菌[CMCC(B)50094]、大肠埃希菌[CMCC(B)44102]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、黑曲霉[CMCC(F)98003]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]均购自广东环凯微生物科技有限公司。

1.3 培养基

胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）（批号200909），沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）（批号191112），胰酪大豆胨液体培养基（批号210617），pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液（稀释液）（批号220113），麦康凯液体培养基（批号200308），麦康凯琼脂培养基（批号200815），木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基（XLD）（批号200904），RV沙门菌增菌液体培养基（批号200116），肠道菌增菌液体培养基（批号191231），紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基（批号211125），均来自北京陆桥技术股份有限公司。

1.4 样品

化橘红，来自江西樟树成方中药饮片有限公司，批号20120101。

2 方法与结果

2.1 菌液的制备

根据2020版《中华人民共和国药典》四部通则1105及1006要求，将各试验菌制成菌悬液，终浓度为50～100 cfu/ml。

2.2 供试液的制备

称取一批75 g化橘红，利用GF88DX高压灭菌器进行常规灭菌处理，其中用于沙门菌检查的20 g化橘红未做灭菌处理。

取已灭菌处理的化橘红25 g，加稀释液至250 ml，充分振摇15 min，制得1∶10供试液。取已灭菌处理的化橘红25 g，加稀释液至500 ml，充分振摇15 min，制得1∶20供试液。1∶10供试液20 ml，加稀释液至100 ml，混匀，制得1∶50供试液。取1∶10供试液、1∶20供试液、1∶50供试液各20 ml于沸水浴中加热30 min，冷却后分别作为1∶10、1∶20、1∶50耐热菌检查用供试液。

2.3 微生物计数方法适用性试验

2.3.1第一次微生物计数方法适用性试验

2.3.1.1需氧菌总数试验试验组取1∶10的供试液9.9 ml，5份，分别加入5种试验菌（0.1 ml）混匀，各取1 ml注入培养皿中，倾注TSA，平行制备2皿。供试品对照组：用稀释液替代菌液，其他操作同试验组。菌液对照组：取5份9.9 ml的稀释液，分别加入0.1 ml各菌液，其他操作同试验组。

2.3.1.2霉菌和酵母菌总数试验 取9.9 ml 1∶10的供试液各2份，分别加入0.1 ml的白色念珠菌、黑曲霉菌菌液，混匀后取1 ml注入培养皿，倾注SDA，其他操作同需氧菌总数试验。

2.3.1.3耐热菌总数试验取1∶10耐热菌检查供试液9.9 ml 5支，其他操作同需氧菌总数试验。

2.3.1.4结果依据《中华人民共和国药典》2020版四部通则1108，回收率=（试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数）/菌液对照组平均菌落数×100%，平皿倾注法中各试验菌的回收率应在50%～200%标准范围内。由表1可得知，需氧菌、耐热菌总数回收率试验中金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的回收率值小于50%，不符合标准要求，故该常规法（1∶10）不适用于检测化橘红需氧菌、耐热菌总数。可采用增加稀释液的方法，进行方法适用性试验[12]。霉菌和酵母菌所对应的两种试验菌回收率在77%～89%，符合《中华人民共和国药典》要求。

表1 1∶10供试液需氧菌/耐热菌总数、霉菌和酵母菌总数方法适用性试验结果

2.3.2第2次微生物计数方法适用性试验需氧菌总数试验：取9.9 ml的1∶20供试液5份，其他操作与“2.3.1”需氧菌总数试验相同。耐热菌总数试验：分别取1∶20耐热菌总数检查供试液9.9 ml 5份，其他操作与需氧菌总数相同。由表2可知，金黄色葡萄球菌的回收率在50%～200%范围内，但枯草芽孢杆菌的回收率小于50%，不符合《中华人民共和国药典》要求，说明化橘红对枯草芽孢杆菌具有一定抑制作用，因此将供试品进一步稀释，进行回收率试验。

表2 1∶20供试液需氧菌/耐热菌总数方法适用性试验结果

2.3.3第3次微生物计数方法适用性试验需氧菌总数试验：取9.9 ml的1∶50供试液5份，其他操作同“2.3.1”需氧菌总数试验。耐热菌总数试验：取9.9 ml的1∶50耐热菌总数检查供试液5份，其他操作与需氧菌总数试验相同。由表3可知，5种计数菌的回收率均在50%～200%范围内，符合《中华人民共和国药典》要求，即采用该微生物计数方法进行需氧菌、耐热菌总数回收率试验。

表3 1∶50供试液需氧菌总数、酵母菌总数方法适用性试验结果

2.4 控制菌方法适用性试验

2.4.1试验组大肠埃希菌：取1∶10供试液10 ml加入100 ml TSB混匀，再加入大肠埃希菌液（不大于100 cfu/ml）1 ml，摇匀后置于30～35 ℃培养24 h。取1 ml上述培养物接种于100 ml麦康凯液体培养基中培养后，划线接种于麦康凯琼脂培养基，观察是否有菌落生长并鉴定。

沙门菌试验：取制备好的供试品10 g各2份，分别加入100、200 ml TSB混匀，各加入沙门菌液1 ml，30～35 ℃培养24 h。取0.1 ml上述培养物，加入9.9 ml RV沙门增菌液体培养基中培养后，划线接种于XLD平板，观察是否有菌落生长并鉴定。

耐胆盐革兰阴性菌：取20 ml在23 ℃培养2 h的0.1 g供试液，用TSB稀释制成0.01 g、0.001 g供试液。取培养后的0.1 g供试液2 ml，分别加入到两管10 ml肠道菌增菌液体培养基中，每管1 ml，接着两管分别加入大肠埃希菌液和铜绿假单胞菌液（均不大于100 cfu/ml）。0.01 g、0.001 g供试液同法操作。将以上6支试管置于33 ℃培养48 h后，划线于紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上培养后，观察是否有菌落生长并鉴定。

2.4.2对照组供试品对照组用稀释液替代菌液，其他操作同2.4.1试验组。阴性对照组用10 ml稀释液替代供试品，不加菌液，其他操作同2.4.1试验组。阳性对照组不加入供试品，其他操作同2.4.1试验组。

2.5 控制菌检查方法适用性试验结果

2.5.1大肠埃希菌由表4的结果可知，试验组和阳性对照组有大肠埃希菌生长，而供试品对照组、阴性对照组无大肠埃希菌生长。

表4 大肠埃希菌微生物检查方法适用性试验结果

2.5.2沙门菌化橘红沙门菌检查采用直接接种法，TSB体积为100 ml的试验组未检出沙门菌，说明化橘红对沙门菌有一定的抑制作用。当TSB体积为200 ml时，由表5的指示结果可知，试验组和阳性对照组有沙门菌生长，而供试品对照组、阴性对照组无沙门菌生长。

表5 沙门菌微生物检查方法适用性试验结果

由表6结果可知，化橘红耐胆盐革兰阴性菌检查试验中肠道菌增菌液体培养基体积为10 ml，试验组和阳性对照组中各稀释级（0.1 g、0.01 g、0.001 g）均检出大肠埃希菌和铜绿假单胞菌，供试品对照组、阴性对照组无目标菌落生长。试验结果表明耐胆盐革兰阴性菌检查可采用直接接种法。

表6 耐胆盐革兰阴性菌微生物检查方法适用性试验结果

3 讨论

作为中医药重要特色和优势之一的中药饮片，其质量控制在中药质量控制中处于薄弱环节[12-13]。患者常需煎煮或泡服中药饮片，而经过高温处理后某些污染微生物可能依然能够存活，会对患者的用药安全性造成威胁[14]。本研究通过对化橘红进行微生物限度适用性试验，可为药品检验机构及药品生产企业进行该饮片的质量检查提供检查方法参考，中药饮片的用药安全及微生物质量控制提供支持。

本研究发现采用常规方法将化橘红制成1∶10稀释度的供试液进行需氧菌、耐热菌总数回收试验时，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌回收比值不达50%，表明化橘红含有对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌有明显抑菌作用的成分；采用溶液稀释法，将化橘红制成1∶50的供试液后进行试验，各菌株回收率均符合《中华人民共和国药典》要求，最终确认用1∶50稀释度进行化橘红的需氧菌、耐热菌总数试验。采用常规法进行霉菌和酵母菌总数试验，各菌株回收率均符合《中华人民共和国药典》要求。采用直接接种法开展控制菌试验，试验组均能检出试验菌，最终亦确认以直接接种法进行化橘红控制菌检查。