金耳总黄酮的体外抗氧化作用

殷金玲 马 亮

金耳是一种金黄色、体态如脑状、柔软鲜嫩、具有弹性和韧性的可食用菌种，别名脑耳、脑形银耳、金黄银耳等。从1815年起菌物学家对其特异性开展了深入研究，发现金耳与传统食用菌木耳、香菇等不同，需正式建立一个全新菌种。金耳实体是由外层的金耳与内侧的革菌组成的一种异质复合体，因此引种驯化十分困难。直至20世纪80年代初，我国才开始进行人工栽培研究。金耳具有喜光、好气、耐干旱、抗寒冷等特点，故主要生长在云南、四川、贵州等高海拔山区，产量稀少。金耳是优质的食药兼用菌，其润滑爽口，富含活性多糖及多种生物碱、黄酮等成分，具有抗氧化、降血糖、调节免疫力、补益身心、延年益寿等作用。近年来对金耳的保健功效研究逐渐增多，如李元伟等[1]利用气相质谱对金耳实体石油醚层提取物进行体外抗氧化研究。冯冰等[2]则发现金耳多糖降解产物可影响角质细胞保湿相关蛋白的表达。蒋益等[3]则通过响应面对超声波辅助提取金耳多糖的工艺进行了优化和探究。邓云霞和瞿伟菁[4]则发现金耳胞外多糖能够明显抑制H2O2诱导的红细胞溶血，降低肝细胞的自氧化。

黄酮是一类广泛存在于蔬菜、水果、食用菌等植物及菌类中的天然多酚类化合物。现有实验数据表明，黄酮具有抗炎症、抗氧化、抗肿瘤、清除体内自由基等广泛、优良的生物学效应，拥有良好的开发前景。由于金耳中多糖含量明显高于其他可食用菌种，因此目前对金耳的研究主要以提取多糖、氨基酸等成分及其相关生物活性物质为主，而对黄酮作用的研究极其有限。本实验以金耳为原料，通过微波辅助萃取总黄酮，研究其对自由基的清除能力及体外还原能力，进而确定金耳总黄酮的体外抗氧化作用，以期为今后金耳精深加工提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料

金耳鲜品采购于四川广元；芦丁对照品（江西佰草源生物科技有限公司）；无水乙醇、Tris-HCl缓冲液、盐酸、H2O2、氢氧化钠、铁氰化钾、抗坏血酸、邻苯三酚，分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。

101-1A型电热鼓风干燥箱（天津天泰仪器有限公司）；DZKW-2型电热恒温水浴锅（天津天泰仪器有限公司）；TU-1901型双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；AR224CN型电子分析天平（奥豪斯仪器（常州）有限公司）；80-2型台式离心机（常州润华电器有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）型循环水式真空泵（郑州予华仪器制造有限公司）。

1.2 方法

1.2.1微波萃取金耳总黄酮将新鲜金耳清洗干净，切成块状，放入65 ℃烘箱烘干。粉碎，过100目筛。称取适量金耳细粉，在料液比1:20，微波时间4 min，微波功率400 W，乙醇浓度60%条件下，在微波中浸提。过滤，得到金耳萃取液，备用。

1.2.2绘制芦丁标准曲线 精密称取4.0 mg芦丁标准品，置于10 ml容量瓶中，用70%乙醇定容，配制成0.4 mg/ml浓度的标准品溶液。摇匀，用移液枪分别在比色管中吸取芦丁标准品溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 ml，然后加入70%乙醇，使总体积达1.2 ml，摇匀备用。再加入0.2 ml 5.0%亚硝酸钠溶液及0.2 ml 10.0%硝酸铝溶液，两次混合后各静置6 min。最后再加入2 ml 4%氢氧化钠溶液，混合后静置15 min。在波长510 nm处测定吸光值。设横坐标为芦丁浓度，纵坐标为吸光值，制作标准曲线回归方程[5]。

1.2.3金耳总黄酮萃取率的测定准确称取5.00 ml萃取液置于50 ml容量瓶中，稀释10倍，作为待测样品，根据萃取液的吸光值和回归方程计算实际萃取率。将测得的吸光度值代入芦丁回归方程公式中，可以测得萃取液中总黄酮浓度（C），再计算出样品中的金耳总黄酮萃取率，公式如下：

金耳总黄酮萃取率（%）=C×V×N×100/M

C为萃取液中金耳总黄酮的浓度，mg/ml；V为萃取液体积，ml；N为稀释倍数；M为金耳细粉样品质量，g。

1.2.4金耳总黄酮清除羟基自由基的测定取2 ml 7.5 mmol/L邻二氮菲试剂，加入4 ml 0.2 mmol/L的磷酸盐缓冲液，以及2 ml不同浓度的被测样品，经摇匀后，再加入2 ml 0.75 mmol/L的硫酸亚铁溶液和2 ml 0.01%的H2O2，再次充分摇匀，在37 ℃条件下水浴1 h。在536 nm处测定吸光度，得到A1；用去离子水替代H2O2，得到吸光值A2；用去离子水代替被测样液得到空白参照，得到吸光值A空白[6]。计算公式如下：

羟基自由基清除率（%）=（A1-A空白）/（A2-A空白）×100

1.2.5金耳总黄酮清除超氧阴离子自由基的测定取6只已编号的试管，分别加入4.5 ml pH8.2的Tris-HCl缓冲液，再依次加入0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml的总黄酮萃取液，然后逐一加入去离子水1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0.0 ml，充分混合，在恒温水浴箱中用25 ℃保温20 min，再迅速加入已预热的0.3 ml 3 mmol/L邻苯三酚溶液开始反应，5 min后立即用10 mol/L盐酸溶液2滴终止反应。参照上述步骤，另取6只编号试管，依次加入Tris-HCl缓冲溶液、总黄酮萃取液、去离子水，用0.3 ml 3 mmol/L邻苯三酚溶液启动反应，用10 mol/L盐酸溶液终止反应。在420 nm处测定各试管的吸光度值，管0的吸光度为A1，加样的吸光度为A2，然后按照下列公式计算超氧阴离子自由基的清除率：

超氧阴离子自由基清除率（%）=（A1-A2）/A1×100

1.2.6金耳总黄酮清除DPPH自由基的测定首先制备0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液，分别吸取DPPH溶液4 ml加入不同的试管中，然后加入0.2 ml不同浓度的被测样品，均匀混合，放在暗室内反应0.5 h，然后在波长517 nm下测定其吸光度，设为A1；以DPPH溶液4 ml中加入70%乙醇0.2 ml的吸光度作为A0，无水乙醇4 ml中加入0.2 ml萃取液的吸光度作为A2；根据下式计算DPPH自由基清除率：

DPPH自由基清除率（%）=[1-（A1-A2）/A0]×100[7]

1.2.7 金耳总黄酮相对还原能力的测定在不同体积的样品溶液中依次加入pH6.6、0.2 mol/L的磷酸盐缓冲溶液2.5 ml，再加入1%铁氰化钾溶液2.5 ml，充分混合后，放置于50 ℃水浴箱中反应20 min，然后取出再急速冷却，随后加入10%三氯乙酸溶液2.5 ml进行定容[8]，用离心机离心10 min，转速为3 000 r/min。取离心上清液5 ml，加去离子水4 ml，再加0.1% FeCl3溶液0.5 ml，均匀混合10 min后，在700 nm处测定吸光值，以相同浓度的乙醇溶液作为空白对照，平行测定3次。吸光值越大则表明其还原能力越强。

2 结果

2.1 芦丁标准曲线制作

绘制标准曲线，以浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，标准曲线线性回归方程为A=9.616 1x+0.044 3（R2=0.999 3）。

2.2 金耳总黄酮萃取含量的测定

在波长510 nm处测定金耳萃取液吸光度，然后通过回归方程计算出金耳中总黄酮的含量为0.683 2%。

2.3 羟基自由基的清除能力

以维生素C（VC）作为参照对象，当金耳总黄酮浓度小于0.05 mg/ml时，两者对于羟基自由基的清除作用基本相近，无明显差距。当逐渐增加双方浓度时，金耳总黄酮的羟基自由基清除速率快速上升，VC上升过程呈平缓状态。当浓度上升到0.14 mg/ml时，VC对羟基自由基的清除率仅为58%，而金耳总黄酮对羟基自由基的清除率则高达84%。见图1。

图1 金耳总黄酮和VC对羟基自由基的清除能力

2.4 超氧阴离子自由基的清除能力

与VC清除效果比较，在同等浓度条件下均显著优于VC的清除效率。当金耳总黄酮浓度为0.07 mg/ml时，超氧阴离子自由基的清除率达91%。见图2。

图2 金耳总黄酮和VC对超氧阴离子自由基的清除能力

2.5 DPPH自由基的清除能力

从图3可以看出，金耳总黄酮对DPPH自由基的清除率与加样浓度成明显的线性关系，当样品浓度达0.12 mg/ml时，其对DPPH自由基的清除率维持在90%上下，同等条件下VC对DPPH自由基的清除率接近85%。

图3 金耳总黄酮和VC对DPPH自由基的清除能力

2.6 相对还原能力

通过图4可以看出，金耳总黄酮的相对还原能力与加样浓度成较好的线性关系，还原能力随着样品浓度增加，逐渐增强。VC具有较强的还原能力，金耳总黄酮的还原能力低于同浓度VC。

图4 金耳总黄酮和VC的还原能力比较

3 讨论

超氧阴离子自由基是由基态氧结合了一个电子而形成的氧自由基，其广泛存在于生物体内，当其与羟基结合后，会破坏人体细胞DNA结构，使细胞膜相系统发生脂质过氧化，加速细胞裂变凋亡。故清除体内超氧阴离子自由基可起到缓解细胞损伤，维持体内代谢平衡，延缓衰老等作用。DPPH自由基是目前广泛使用的用于评价抗氧化性的检验指标。其在有机溶剂中有良好的稳定性，自由基清除剂能够使其颜色变浅，进而根据吸光度的变化，来判断清除自由基的能力[9-10]。以新鲜金耳为原料，利用微波萃取其总黄酮成分，得到总黄酮含量为0.683 2%。金耳总黄酮具有优良的体外抗氧化作用，可以作为天然抗氧化剂使用。当浓度为0.14 mg/ml时，金耳总黄酮对羟基自由基的清除率为84%；当浓度为0.07 mg/ml时，金耳总黄酮对超氧阴离子自由基的清除率为91%；当样品浓度为0.12 mg/ml时，其对DPPH自由基的清除率达90%上下。同时金耳总黄酮还有较强的还原能力，但相对还原能力不如VC。金耳作为一种新型食药用菌，具有广阔的市场开发前景，本研究对金耳总黄酮的体外抗氧化作用进行了研究，可为后续进一步开发新产品提供理论依据。