HPLC切换波长法同时测定金花消痤丸中5种成分

【摘 要】 目的：建立HPLC法同时测定金花消痤丸中5种成分含量的方法。方法：色谱柱为依利特C₁₈色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为0.1%甲酸溶液-乙腈，梯度洗脱；流速为1.0 mL/min；柱温为30 ℃；检测波长为220 nm、225 nm、238 nm、275 nm；进样量为10 μL。结果：没食子酸、栀子苷、黄芩苷、汉黄芩苷、大黄酚分别在1.81～54.24 μg/mL（r=0.9994）、23.91～717.3 μg/mL（r=0.9997）、17.11～513.33 μg/mL（r=0.9996）、3.57～106.98 μg/mL（r=0.9998）、1.72～51.45 μg/mL（r=0.9996）范围内线性关系良好，平均回收率（RSD）分别为99.13％（0.87%）、100.33％（0.51%）、99.30％（0.64%）、100.64％（0.70%）、98.48％（1.07%）。结论：本方法简便、高效、可靠，可用于金花消痤丸的质量控制。

【关键词】 金花消痤丸；5种成分；HPLC；含量测定

【中图分类号】R284.2   【文献标志码】 A    【文章编号】1007-8517（2024）03-0062-05

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.03.zgmzmjyyzz202403014

Simultaneous Determination of Five Constituents in Jinhua Xiaocuo Pills by HPLC Wavelength Switching Method

GUI Lihua

Center for Food and Drug Inspection of Yunnan Province， Kunming 650106，China

Abstract：Objective  To establish an HPLC method for the simultaneous content determination of five constituents in Jinhua Xiaocuo pills. Methods  The determination was performed on Yilite C₁₈column（4.6 mm×250 mm，5μm）with mobile phase consisted of 0.1% formic acid solution-acetonitrile at the flow rate of 1.0 ml/min. The column temperature was 30 ℃，and the detection wavelengths were set at 220 nm，225 nm，238 nm and 275 nm.The injection volume was 10 μL. Results   The method achieved good linearity in the ranges of 1.81-54.24 μg/mL（r=0.9994）for Gallic acid，23.91-717.3 μg/mL（r=0.9997）for Geniposide，17.11-513.33 μg/mL（r=0.9996）for Baicalin，3.57-106.98 μg/mL（r=0.9998）for Wogonoside and 1.72-51.45 μg/mL（r=0.9996）for Chrysophanol.The average recoveries were 99.13％（0.87%），100.33％（0.51%），99.30％（0.64%），100.64％（0.70%），98.48％（1.07%）.Conclusions  This simple， efficient and reliable method can be used for the quality control of Jinhua Xiaocuo pills.

Keywords：Jinhua Xiaocuo Pills；Five Constituents；HPLC；Determination

痤瘡是一种青春期常见的毛囊皮脂腺的慢性炎症疾病，其主要由雄激素分泌增多，皮脂腺分泌亢进，毛囊皮脂腺导管阻塞角化异常，导致皮脂排泄障碍，皮脂潴留，继发痤疮丙酸杆菌感染所致^［1］。中医认为痤疮多为风热犯肺证，属肺风粉刺范畴。金花消痤丸是由栀子（炒）、金银花、黄芩（炒）、大黄（酒炙）、黄连、桔梗、薄荷、黄柏、甘草9味中药制成的浓缩水丸。具有清热泻火、解毒消肿之功效，用于肺胃热盛所致的痤疮、粉刺、胃火牙痛、口舌生疮、喉咙肿痛、目赤、便秘、尿黄赤。栀子泻火除烦、清热利尿、凉血解毒，金银花清热解毒，黄芩清肺热、泻上焦之火，大黄凉血解毒、清泻实热，黄连泻心火兼泻中焦之火，黄柏泻下焦之火，各药合用，清上和泻下并行共同发挥清热解毒、凉血泻火、清痈散结之功效。现行质量标准无含量测定项目。文献报道，陈磊^［2］采用HPLC法测定栀子苷含量，汪艳等^［3］采用HPLC法测定大黄酸、大黄素、大黄酚及大黄素甲醚含量，汪艳^［4］采用HPLC法测定盐酸小檗碱含量，但都是对组方中的一味药材中的一种或几种成分进行测定，没有对多味药材中多种成分同时测定的研究报道，不利于从整体上控制该制剂质量。本文参考文献^［5-20］，建立了HPLC法同时测定金花消痤丸中栀子苷、黄芩苷、汉黄芩苷、没食子酸、大黄酚含量的方法，为该制剂标准提升提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器 LC-20AT型高效液相色谱仪（Shimadzu），UV-2401PC型紫外可见分光光度计（Shimadzu），XSE205型电子天平（Mettler Toledo），KQ-300VDB双频数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），电热恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器有限公司）。

1.2 材料 栀子苷 （批号：110749-201718； 含量：97.6%）、黄芩苷 （批号： 110715-201619； 含量： 93.5%）、 汉黄芩苷（批号：112002-201702；含量：98.5%）、没食子酸（批号：110831-201605；含量：90.8%）、大黄酚（批号：110796-201621；含量：99.2%），以上对照品均购置于中国食品药品检定研究院；金花消痤丸（批号：271288，200167，201814，210315，210823，211584；生产企业A）；乙腈为色谱纯（Merck KGaA）；水为超纯水（自制）；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：依利特C₁₈色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～35 min，4%→39% B，35～50 min，39%→78% B，50～60 min，4% B）；检测波长：0～11 min，220 nm（没食子酸）；11～26 min，238 nm（栀子苷）；26～40 min，275 nm（黄芩苷、汉黄芩苷）；40～60 min，225 nm（大黄酚）；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取栀子苷、黄芩苷、汉黄芩苷、没食子酸、大黄酚对照品适量，加甲醇制成分别含上述对照品2.3910 mg/mL、1.7111 mg/mL、0.3566 mg/mL、0.1808 mg/mL、0.1715 mg/mL的混合对照品储备液。精密量取混合对照品储备液2.5 mL，置25 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。

2.2.2 供试品溶液 取金花消痤丸适量，研细，混匀，精密称取约0.8 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称重，超声（400 W，40 kHz）提取30 min，放冷，用甲醇补足重量，摇匀，静置，取上清液滤过，即得。

2.2.3 阴性样品溶液 按处方分别制得缺栀子、缺黄芩、缺大黄的阴性样品，按“2.2.2”项下制备。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 精密吸取“2.2.1”项下的混合对照品储备液0.25 mL、0.5 mL、1.25 mL、2.5 mL、5.0 mL、7.5 mL，分别置25 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。滤液分别进样10 μL，记录峰面积。以浓度（X）、峰面积（Y）分别为为横、纵坐标，进行线性回归，各成分有良好的线性关系，详见表1。

2.3.2 专属性试验 分别吸取“2.2”项下的各溶液，在“2.1”项色谱条件下测定，结果显示，阴性样品不干扰测定，如图1所示。

2.3.3 精密度试验 精密吸取“2.2.1”项下的溶液进样6次，每次10 μL，记录峰面积。结果，栀子苷、黄芩苷、汉黄芩苷、没食子酸、大黄酚的RSD依次为0.45%、0.53%、0.34%、0.43%、0.61%。表明仪器有良好的精密度。

2.3.4 重复性试验 取同一批（批号：271288）样品6份，按“2.2.2”制备，测定栀子苷、黄芩苷、汉黄芩苷、没食子酸、大黄酚的含量，其含量的RSD依次为0.58%、0.70%、0.81%、0.77%、1.02%。

2.3.5 稳定性试验 取 “2.2.2”项下制备的同一供试品溶液，分别在0 h、5 h、10 h、20 h、36 h时进样10 μL，记录峰面积。结果，栀子苷、黄芩苷、汉黄芩苷、没食子酸、大黄酚峰面积的RSD依次为0.49%、0.69%、0.48%、0.67%、0.81%，表明供试品溶液在36 h内稳定。

2.3.6 回收率试验 精密称取已测定含量的金花消痤丸（批号：271288）6份，每份约0.4 g，精密加入“2.2.1”项下的混合对照品储备液2.5 mL，再精密加入甲醇47.5 mL，按“2.2.2”项下制备。测得回收率，详见表2。

2.4 样品测定结果 取6批金花消痤丸，按“2.2.2”项下制备，测定含量，结果见表3。结果显示，6批次金花消痤丸中没食子酸、栀子苷、黄芩苷、汉黄芩苷、大黄酚含量最大值是最小值的1.40倍、 1.42倍、1.29倍、1.27倍、1.55倍，各成分的平均值 （RSD） 为1.8096 （18.14%）、 12.8675 （12.31%）、 13.6489 （8.94%）、 2.2119 （8.51%）、 1.0487（15.05%），说明各成分含量之间存在一定差异，特别是含量较小的没食子酸和大黄酚其RSD达18.14%和15.05%，产生这种结果的原因可能与处方中各药材的产地、生长年限、采收季节、炮制方法等多种因素有关。

3 讨论

3.1 指标成分的选择 黄光强等^［18］、史永平等^［19］、王玉等^［20］均基于Q-marker理论预测分析，得出黄酮及其苷类化合物是黄芩发挥抗炎的物质基础，栀子苷为栀子药理作用的活性成分，蒽醌类及其衍生物成分是大黄泻下攻积、清热泻火、凉血解毒的物质基础。根据上述文献^［18-20］，选择了黄芩苷、汉黃芩苷、栀子苷、没食子酸、大黄酚为该制剂的质控指标。

3.2 提取方法的选择 参考文献^［5-17］，首先考察了提取溶剂（乙醇和甲醇）及提取溶剂浓度（50%、75%、100%），100%甲醇提取时杂峰少且基线平稳，其次考察提取方法（回流和超声），两者没有显著差异；再次考察了提取时间（20 min、30 min、40 min），发现超声提取30 min后5种成分的含量均未再增加。最终定用100%甲醇超声（400 W，40 kHz）提取30 min。

3.3 检测波长的选择 分别取黄芩苷、汉黄芩苷、栀子苷、没食子酸、大黄酚对照品的甲醇溶液在190～500 nm范围内进行扫描，黄芩苷在215 nm和278 nm、汉黄芩苷在275 nm、栀子苷在238 nm、没食子酸在220 nm和272 nm、大黄酚在225 nm和254 nm处有最大吸收。曾尝试用单一波长同时检测以上5种成分，当用225 nm或220 nm或215 nm时，栀子苷和汉黄芩苷响应值偏低，当用238 nm時，其它4种成分响应值均偏低，当用275 nm时，大黄酚和栀子苷响应值偏低，不利于定量测定，故选择切换波长进行测定。

3.4 流动相的选择 曾尝试用乙腈-水或甲醇-水不含酸系统进行分离，但没食子酸拖尾严重，为改善没食子酸拖尾现象。根据文献^［5-17］，流动相初步定为甲醇-0.1%甲酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液，实验发现乙腈-0.1%甲酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液洗脱能力强，基线平稳，5种成分分离度和峰形均良好。0.1%磷酸溶液的pH值为3左右，酸性较强，不利于色谱柱的使用，为延长色谱柱使用寿命，选择了酸性相对弱一些的乙腈-0.1%甲酸溶液，并进行梯度洗脱为本实验的流动相。

3.5 测定结果分析 从样品测定结果来看，各种成分含量在不同批次之间存在一定差异。为了达到中药复方制剂质量的稳定可靠，建议药品生产企业对药材来源的稳定性加强把控，如相对固定产地、采收季节等，并建立科学有效的检测方法对各味药材进行质量控制，保障药品质量稳定，确保发挥较好的临床疗效。

现代医学研究^［21-22］表明，金花消痤丸治疗痤疮疗效明显。栀子、大黄、黄芩对丙酸杆菌有一定的抑菌作用，调节皮脂分泌，同时还可以使大便变软和促进排便，改善体内环境，是金花消痤丸发挥疗效的重要药味。中药复方制剂的临床疗效是来自组方中各味中药的共同作用，为确保临床疗效，同时控制多味中药质量非常必要。该方法能同时测定金花消痤丸中5种成分的含量，对确保金花消痤丸的临床疗效发挥了积极的作用。

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（收稿日期：2023-05-04 编辑：杜玲玉珊）

作者简介：桂立华（1989—），女，汉族，本科，主管药师，研究方向为药品质量标准研究。E-mail：504614512@qq.com