稀释涂布平板法计数微生物的四大误区

张艳娟　陈兆亮　郭建坤

稀释涂布平板法是一种常见的微生物计数方法，该方法通过统计平板上的菌落数推测样品中活菌个数，其原理是将待测样品稀释适当倍数，使样品中的微生物细胞分散开，再取一定量的稀释液均匀涂布到固体培养基表面，让分散开的单个细胞繁殖得到一个菌落，这样就可以通过肉眼可见的菌落数推理肉眼不可见的微生物细胞数。稀释涂布平板法计数微生物的计算公式为每克样品中的菌株数=（C÷V）xM，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用稀释液的体积，M代表稀释倍数。学生对该公式的理解存在多种认知误区，导致此类问题得分率低，现结合典型试题进行分析。

误区一 对平均菌落数的理解

公式中的C不一定是所有实验所得菌落数的平均值，为增强实验说服力和减小实验误差，本实验应设置对照实验和重复实验，此实验的对照实验是将未涂布菌液的培养基放置在相同条件下培养，其目的是排除培养基污染对实验结果产生的影响。若空白对照组平板出现菌落，则说明空白对照组的平板被污染，进而推测实验组平板也可能被污染，这种情况不能直接将实验组平板的菌落数取平均值，应重新进行实验，只有空白培养基没有出现菌落，实验结果才可信，此实验的重复实验是将同一稀释度的稀释液至少涂布3个平板（一般设置3-5个平板），选择菌落数在30-300的平板计算平均菌落数。若重复实验中某个平板的菌落数与其他差别甚远，如四个平板的菌落数分别为42、200、256、234，菌落数42与其他数值差异过大，说明该平板操作过程有误，则该菌落数应舍弃，若舍弃后不足三个平板，不能用菌落数相近的两个平板取平均值，应找到原因并重做实验。若计算每克样品中的某种菌株数，则C应代表某一稀释度下平板上生长的符合该菌菌落特征的菌落数的平均值，培养基上其他菌种形成的菌落数不能一并计算在内。如检测1L待测水样中的大肠杆菌数目只统计大肠杆菌菌落数的平均值。

例1 在5个细菌培养基平板上均接种稀释倍数为105的土壤样品溶液0.1mL，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为13、150、160、170和591，每克土壤样品中的细菌数量为____个。

解析 应选择菌落数在30-300的平板计算平均菌落数，舍弃菌落数为13和591的平板，所以平均菌落数为（150+160+170）÷3=160，每克样品中的菌株数=（C÷V）xM=160÷0.1x105=1.6x108个。

误区二 对稀释倍数的判定

平板中菌落数过少会导致计数误差过大，菌落数过多又会造成计数困难，为确保有效活菌数的准确测定，应合理设定稀释倍数。待测样品中微生物数量越多，所需稀释倍数越大，而微生物数量越少，所需稀释倍数越小，如测定土壤中细菌数量，一般选用104、105和106倍稀释；测定放线菌数量，一般选用103、104和105倍稀释；测定真菌数量，一般选用102、103和104倍稀释；测定自来水中大肠杆菌数量，一般不稀释，直接进行涂布培养。人教版高中生物教材给出的样品稀释的流程示范是将10g土样加入到90mL无菌水中得到稀释10倍的样液，从稀释10倍的样液中取1mL加入到9mL无菌水中得到稀释100倍的样液，依次类推（图1）。若取6g土样配制成稀释10倍的土壤溶液，则土壤占混合液的10%，土壤溶液总量为60mL，应添加54mL的无菌水。若取Ig土样配制成稀释100倍的土壤溶液，则土壤占混合液的1%，土壤溶液总量为100mL，应添加99mL的无菌水。

例2 佩戴口罩是预防病原体感染的有效措施之一。使用过的口罩，如果没有妥善处理会对生态环境造成巨大威胁，某科研团队欲从不同环境的土壤中筛选出能高效降解一次性口罩（主要成分是聚丙烯纤维）的细菌，请回答下列问题：

（1）运用图2所示方法对土样中的细菌计数，分别在3个平板上滴加0.1mL稀释液，经适当培养后，3个平板上菌落数分别是65、66和67，则1g土壤中的活菌数约为____个。

解析 本题的关键是根据图示判断稀释倍数，将1g土样加入到99mL无菌水中，相当于直接将土样稀释了100倍，再从稀释100倍的样液中取1mL加入到9mL无菌水中得到稀释1000倍的样液，到图中的第四个试管，土样已经被稀释106倍，则每克样品中的菌株数=（C÷V）×M=（65+66+67）÷3÷0.1×106=6.6×108个。

误区三 对体积与质量的单位换算

微生物计算公式中的V代表涂布平板时所用稀释液的体积，通常为0.1mL，但若待测样品中微生物数目较少，接种0.1mL经培养后平板上菌落数达不到30，可增大接种量（如接种1mL）。试题中经常改变涂布平板时所用的稀释液和所求样品的体积和质量，要注意做好单位换算，如1cm3=103μL=1mL=10-3L体积和质量的换算公式是体积=质量÷密度（v=m/ρ），水的密度是1g/cm3，则质量为1g的水的体积是1cm3即1mL。

例3 牛、羊等反刍动物具有特殊的器官——瘤胃，在瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物能分解尿素。图3是研究人员从瘤胃提取物中获得尿素分解菌的流程。

（1）实验中初步估测甲瓶中细菌数为3×106个/mL，若要在每个平板上涂布100μL稀释后的菌液，且保证每个平板上长出的菌落数不超过300个，则至少应将甲瓶的菌液稀释____倍。

解析 1μL等于10-3mL，涂布100μL菌液则涂布0.1mL.设至少应将甲瓶的菌液稀释X倍，则300÷0.1x10x=3×106，计算可得X=3，即至少应将甲瓶的菌液稀释103倍。

误区四 对统计误差的分析

从稀释涂布平板计数的原理分析，运用该方法统计的菌落数往往比活菌的实际数日低，因为样品一般不易完全分散成单个细胞，当两个或多个活细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，从稀释涂布平板计数的过程分析，稀释倍数是否合适、涂布是否均匀、培养环境是否能保证微生物正常生长、计数是否存在漏计或重复计数等情况都会影响统计结果。除此之外，还要考虑培养时间对菌落数目的影响，菌落数目需要每隔一段时间统计一次，選取菌落数目稳定时的记录作为结果，防止因培养时间不足遗漏菌落的数目。

例4 中国科学家运用合成生物学方法构建了一株嗜盐单胞菌H，以糖蜜（甘蔗榨糖后的废弃液，含较多蔗糖）为原料，在实验室发酵生产PHA等新型高附加值可降解材料，期望提高甘蔗的整体利用价值，工艺流程如图4，请回答问题。

（1）为提高菌株H对蔗糖的耐受能力和利用效率，可在液体培养基中将蔗糖作为____，并不断提高其浓度，经多次传代培养（指培养一段时间后，将部分培养物转入新配的培养基中继续培养）以获得目标菌株。培养过程中宜采用____法对样品中的活菌进行接种和计数，以评估菌株增殖状况。若某次取样中，对菌液稀释了105倍后，在每个平板上涂布菌液的体积为0.1mL，平板上的平均菌落数为220个，则菌液中H菌的细胞数为____个/L.菌落数目需要每隔一段时间统计一次，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样做的目的是____。

解析 该研究的目的是提高菌株H对蔗糖的耐受能力和利用效率，结合微生物的代谢需求，其液体培养基应该以蔗糖作为唯一碳源。稀释涂布平板法可以用于统计样品中的活菌数目，菌液中H菌的细胞数=（C÷V）×M=220÷0.1×105=2.2×108个/mL=2.2×1011个/L.选取菌落数目稳定时的记录作为结果是为了防止因培养时间不足而导致遗漏菌落数目，增加实验结果的可信度。

基金项目：河北省教育科学“十四五”规划课题“基于核心素养的高中生物学深度学习研究”阶段性成果，No。2103372）

（收稿H期：2024-02-03）