脑脊液宏基因组二代测序在小儿神经外科术后颅内细菌感染诊断中的应用

谢 岷,司道林,何 剑,邓小鹿,王 霞

(中南大学湘雅医院儿科,湖南 长沙 410008)

神经外科术后颅内细菌感染与围手术期病死率直接相关,严重影响患者的预后,尽早诊断并及时启动抗感染治疗至关重要。目前临床诊断标准存在假阳性率过高[1],从而导致抗菌药物过度使用的问题。由于神经外科手术的特殊性和患者基础疾病的病种及病变部位不同,发热、头痛、呕吐、意识改变、脑膜刺激征、脑脊液常规及生化这些对非手术病例较为特异性的指标,对神经外科术后病例的特异性明显降低,明确诊断需依赖病原学检查,而脑脊液细菌培养需要时间长,阳性率低,生长缓慢的细菌需要更长的培养时间,不利于抗菌药物的合理使用,容易导致临床耐药菌的产生。

宏基因组二代测序(mNGS)技术诊断隐球菌脑脊液感染的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和符合率分别为93.5%、96.0%、87.8%、98.0%、95.4%,提示mNGS具有良好的诊断能力,目前已被纳入《非人类免疫缺陷病毒相关隐球菌性脑膜炎诊断的中国专家共识》[2],尤其是阴性预测值高达98.0%,对于减少过度诊断颅内感染的诊断价值高,但脑脊液mNGS检测结果阴性在神经外科术后颅内感染病例诊断中的应用价值尚未见报道。本文分析2020年1月1日—2023年8月31日在中南大学某医院儿童重症监护病房神经外科术后颅内细菌感染(包括临床诊断及确诊)病例的临床资料,在经验性使用抗颅内感染药物前送检脑脊液培养和mNGS检测。探讨脑脊液mNGS检测结果在儿童神经外科术后颅内细菌感染诊断中的意义,为其临床诊治提供思路。

1 对象与方法

1.1 研究对象 2020年1月1日—2023年8月31日在中南大学某医院儿童重症监护病房住院的神经外科术后符合中枢神经系统感染的病例。诊断标准参照《神经外科中枢神经系统感染诊治中国专家共识(2021版)》[1]:(1)临床诊断病例,病例出现发热(体温>38℃)或低体温(体温<36℃),颅高压症状(头痛、头晕、恶心、呕吐、意识改变),脑脊液浑浊或脓性,白细胞计数(WBC)增高(>100×106/L)、葡萄糖<2.2 mmol/L及脑脊液葡萄糖/血清葡萄糖≤0.4;(2)病原学诊断确诊病例,在临床诊断的基础上,标本涂片、引流管头、植入物及脑脊液微生物培养阳性(排除污染和定植)。

1.2 研究方法

1.2.1 检测时间 病例术后出现发热、脑脊液改变符合术后颅内感染临床诊断标准时,在经验性使用抗颅内感染药物前送检脑脊液培养和mNGS检测。此后连续送脑脊液培养≥1次。

1.2.2 检测方法 (1)传统病原学检测:微生物培养,血、脑脊液、引流管头、植入物等均严格遵照无菌操作,送该院微生物实验室,细菌分离及培养参照微生物学检验诊断常规进行。(2)脑脊液mNGS检测,所有病例均送脑脊液进行mNGS检测,由予果生物科技(北京)有限公司免费检测。基本检测流程包括:标本采集、核酸提取(cell free DNA)、文库建立和生物信息分析。(3)仅脑脊液培养阳性或仅mNGS检测阳性的标本需进行复核。结合临床转归、抗菌药物使用情况,符合以下情况考虑污染:在使用入颅抗菌药物前再次复查脑脊液培养、mNGS检测均阴性,且有效抗菌药物治疗未达疗程时,临床症状很快缓解,脑脊液葡萄糖恢复正常。(4)其他实验室检查和影像学检查,如血常规、尿常规、脑脊液常规、脑脊液生化、胸片或肺部CT、头部MRI等均送该院相应的部门和科室检测、检查。

1.2.3 分组干预措施和比较 分析2020年1月—2021年9月(对照组)及2021年10月—2023年8月(干预组)临床诊断病例入颅抗菌药物使用时间。(1)对照组临床诊断颅内感染后接受经验性抗菌药物治疗,停用入颅抗菌药物指征为至少等待1次脑脊液培养结果阴性,其他停药指征参照文献[1]:①体温正常;②临床感染体征消失;③脑脊液葡萄糖含量正常;④脑脊液常规WBC符合正常标准;⑤血液WBC和中性粒细胞正常。(2)2021年10月起,对同时符合以下情况的临床诊断病例(干预组)不启动入颅抗菌药物经验性治疗:①脑脊液培养24 h及以上未预警,mNGS回报阴性。②血性脑脊液,未使用入颅抗菌药物,复查脑脊液葡萄糖逐渐上升。③对脑脊液培养72 h以上未预警且mNGS阴性的临床诊断病例尽早停用经验性抗颅内感染治疗。④所有病例密切观察,一旦病例临床进展,如出现发热反复、体温峰值上升、意识改变、颅压下降后再上升,则及时再次送脑脊液培养,必要时再次送脑脊液进行mNGS检测,并同时启动经验性抗颅内感染治疗。⑤所有病例停止抗菌药物治疗后随访1个月,体温正常,未出现与原发病无关的新的神经系统症状及体征,临床排除细菌性脑膜炎。

1.3 统计学处理 应用SPSS 23软件进行统计学分析,组间比较采用独立样本非参数检验,P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料 43例病例中,男性29例,女性14例,年龄14个月～18岁。基础疾病:髓母细胞瘤10例,胶质瘤7例,生殖细胞瘤6例,颅咽管瘤3例,胚胎性肿瘤(节细胞瘤)1例,室管膜瘤4例,脑积水2例,症状性癫痫4例,脑血管畸形6例。颅内感染临床诊断组38例,病原学诊断组5例。所有病例均有发热,38例临床诊断颅内感染病例中,5例存在肺部感染,其余病例均未找到颅外感染病灶。

2.2 脑脊液检查结果

2.2.1 脑脊液常规 病原学诊断组病例脑脊液WBC、多核白细胞分类与临床诊断组比较,差异均无统计学意义(χ2分别为0.078、0.028,均P>0.05),见图1A、B。

图1 病原学诊断组与临床诊断组病例脑脊液检查结果比较

2.2.2 脑脊液生化 病原学诊断组病例脑脊液蛋白含量、葡萄糖浓度及脑脊液葡萄糖/血清葡萄糖比值与临床诊断组比较,差异均无统计学意义(χ2分别为1.255、0.003、0.003,均P>0.05),见图1C～E。临床诊断组38例病例中,29例脑脊液糖低考虑为血性脑脊液所致;9例脑脊液中找到肿瘤细胞,考虑为肿瘤转移致葡萄糖低。9例肿瘤转移致葡萄糖低患者中,2例髓母细胞瘤病例术后发热,脑脊液葡萄糖持续低,其中1例放射治疗、化学治疗后肿瘤病灶逐渐增大,最后死亡,另1例放射治疗、化学治疗后葡萄糖逐渐恢复正常。

2.2.3 脑脊液培养 病原学诊断组检出4例阳性(阴沟肠杆菌2例,大肠埃希菌、表皮葡萄球菌各1例),另有2例第一次脑脊液培养阳性(分别为表皮葡萄球菌、少动鞘氨醇单胞菌),在脑脊液培养一级预警时立即复查脑脊液培养,并根据革兰阳性菌和革兰阴性菌分别加用利奈唑胺和美罗培南,此2例病例复查脑脊液时(未使用抗菌药物前)葡萄糖含量已开始上升,体温呈下降趋势,结合脑脊液培养复查结果均阴性,考虑为污染菌株。

2.2.4 脑脊液mNGS mNGS检测病原学阳性5例(阴沟肠杆菌2例,大肠埃希菌、溶血孪生球菌和表皮葡萄球菌各1例),其中包括脑脊液培养4例阳性。此外,2例脑脊液培养怀疑为污染菌株者,mNGS检测均为阴性,脑脊液培养、mNGS检测复查均为阴性;3例病例因反复发热脑脊液葡萄糖低,进行了2次脑脊液mNGS检测,均阴性。

2.3 脑脊液mNGS诊断结果 神经外科术后颅内细菌感染的金标准是细菌培养阳性,临床诊断病例无金标准参照,故对28例临床诊断颅内感染但mNGS检测阴性的病例未进行经验性抗颅内感染治疗,或未达疗程,后根据临床转归及追踪随访均排除细菌性脑膜炎。

2.4 抗菌药物使用情况 病原学诊断组5例病例均进行常规抗感染治疗,1例患儿颅内感染控制后因原发病进展死亡,4例存活,其中1例因并发脑积水,颅内感染控制后行脑室腹腔分流术。对照组共10例临床诊断病例,均予经验性抗颅内感染治疗(拉氧头孢、利奈唑胺单用,或美罗培南与万古霉素或利奈唑胺联用、头孢曲松与利奈唑胺联用),经验性抗颅内感染治疗平均时间为9 d。干预组临床诊断的28例病例中,mNGS病原学检测和脑脊液培养(至少2次)均阴性,结合临床资料,其中16例病例未进行经验性抗颅内感染治疗,另12例病例在mNGS回报阴性后结合临床资料及时停止经验性抗颅内感染治疗,追踪随访28例病例均无细菌性脑膜炎发生,经验性抗颅内感染治疗平均时间为0(0,4) d,远低于对照组抗菌药物平均使用时间8(7,11) d (χ2=10.993,P<0.05)。见表1。

表1 38例临床诊断病例资料及抗菌药物使用情况

3 讨论

神经外科术后颅内细菌感染主要包括术后硬膜外脓肿、硬膜下积脓、脑脓肿、脑膜炎、脑室炎等,局部脓肿或积脓由于有影像学改变,相对容易识别和诊断,而对于细菌性脑膜炎或脑室炎,由于手术干扰,其临床表现、头部影像学、脑脊液常规和生化改变的特异性降低[3-4],如果有高风险因素,且术后出现发热,其诊断具有极大挑战。本研究发现临床诊断组病例脑脊液WBC、多核白细胞分类及脑脊液蛋白、葡萄糖浓度等与病原学诊断组比较,差异无统计学意义(均P>0.05)。尽管相对于脑脊液蛋白和WBC,脑脊液葡萄糖低在诊断神经外科术后中枢神经系统感染意义较大,但一些非感染性中枢神经系统疾病同样可导致脑脊液葡萄糖低,如癌性脑膜炎、蛛网膜下腔出血、白血病/淋巴瘤伴中枢神经系统受累,尤其是癌性脑膜炎,临床上不容易与细菌性脑膜炎鉴别[5]。本研究中38例临床诊断病例,29例脑脊液葡萄糖低考虑为血性脑脊液所致,9例脑脊液中找到肿瘤细胞,考虑肿瘤转移导致葡萄糖低,其中2例髓母细胞瘤病例术后发热,脑脊液葡萄糖持续低,1例放射治疗、化学治疗后肿瘤病灶逐渐增大,最后死亡,另1例化学治疗后葡萄糖逐渐恢复正常,说明传统的脑脊液生化检查对诊断神经外科术后颅内细菌感染存在非特异性,脑脊液病原学检测仍是诊断神经外科术后颅内细菌感染的重要手段。

传统的脑脊液培养阳性率低,且受围手术期抗菌药物使用的影响,细菌培养阳性率仅为30%～60%[6-7]。研究[8-9]发现脑脊液mNGS检测与传统脑脊液培养阳性符合率高,两者联合检测可提高颅内感染病原体检出率。本研究中,脑脊液细菌培养和mNGS检测阳性结果一致,1例病例脑脊液培养阴性,mNGS检测到溶血孪生球菌,结合临床及转归考虑系致病菌,提示脑脊液mNGS检测可以提高儿童神经外科术后颅内细菌感染的病原菌检出率。

mNGS检测病原体阴性的原因有:(1)非感染性因素导致发热或其他类似感染征象;(2)送检标本不合适;(3)RNA病原体感染只做了DNA病原学检测;(4)病原学序列数过低;(5)感染病原体细胞壁较厚,破壁程度不足导致漏检,如隐球菌和结核分枝杆菌[10-11]。《中枢神经系统感染性疾病的脑脊液宏基因组学第二代测序应用专家共识》[10]建议:(1)脑脊液微生物DNA检测结果为阴性时需要考虑RNA病毒感染的可能,建议送检脑脊液微生物RNA检测,并送检RNA病毒相关的抗体检测和聚合酶链反应(PCR)检测;(2)脑脊液mNGS结果为阴性时,临床应关注非感染性病因的可能性,包括自身免疫性脑炎、肿瘤、中枢神经系统血管性疾病等,进一步完成相关检查与鉴别诊断。神经外科术后脑脊液mNGS检测阴性的诊断价值仍处于探索阶段。非感染性病变神经外科术后颅内细菌感染可来源于术中或术后,且特殊病原菌感染可能性小,因此送检脑脊液标本检测细菌DNA不存在标本取样问题,且脑脊液为无菌标本,严格无菌操作下脑脊液mNGS假阳性率不高,理论上术后脑脊液mNGS检测阴性可基本排除颅内细菌感染。Salzberg等[12]对10例有神经系统症状,无法排除感染但传统临床微生物检测结果阴性或检测结果摸棱两可的患者,采用mNGS对脑组织、脑膜组织或脊髓标本进行检测,并同时检测病理结果及追踪临床转归,结果显示5例患者mNGS检测阴性,病理和临床转归排除了感染因素,故认为mNGS阴性结果有助于排除感染因素。由于神经外科术后颅内细菌感染的金标准是细菌培养阳性,临床诊断病例无金标准可参照。虽然本研究通过前瞻性干预,未对脑脊液阴性的临床诊断组28例病例进行经验性抗颅内感染治疗或未达疗程,根据临床转归及追踪随访均排除了细菌性脑膜炎,但脑脊液mNGS检测阴性是否可以排除神经外科术后颅内细菌感染,仍需更多标本进一步验证。

神经外科术后颅内细菌感染预后差,病死率和致残率高,病原学确诊困难。因此,对术后有中枢神经系统感染危险因素的患者,共识中采用临床诊断标准指导经验性抗感染治疗,但经验性抗感染治疗常会选择广谱抗菌药物联合用药,且疗程相对较长,容易导致耐药菌产生。临床诊断病例何时停用抗菌药物也是挑战之一,术后发热和脑脊液糖持续降低原因众多,无法作为持续使用抗菌药物的指征。孟琨等[13]对86例颅脑肿瘤患者术后发热原因分析发现,中枢性高热为颅脑肿瘤患者术后发热的主要原因(44.2%),颅内感染仅占3.4%。因此,寻找客观依据指导临床合理、经验性使用抗菌药物至关重要。能否借助mNGS检测阴性结果指导治疗,目前尚处于探索阶段。Wilson等[11]在一项多中心研究中采用脑脊液mNGS检测和传统方法分析了204例(其中40.8%的患者为免疫抑制患者)有脑膜炎、脑炎或脊髓炎症状患者的病原学,57例患者病因明确为感染因素,其中mNGS阳性31例,而mNGS检测阴性的26例患者中,18例是通过非脑脊液标本诊断(11例通过血清病毒和神经梅毒抗体阳性诊断,7例通过组织标本活检诊断,除脑脊液mNGS外,脑脊液培养、聚合酶链反应和抗原等常规检查均阴性),另8例因脑脊液mNGS检测序列数低于预先设立的阈值,按常规脑脊液检测证实为临界阳性或不确定,故研究认为脑脊液mNGS检测阴性结果联合常规脑脊液病原学检测阴性结果,可以帮助临床医生为疑诊自身免疫性脑炎患者排除活动性感染,从而尽早启动免疫抑制治疗。本研究中,28例临床诊断病例中,mNGS病原学和脑脊液培养均阴性,结合临床资料,其中16例病例未进行经验性抗颅内感染治疗,另12例病例在mNGS回报阴性后结合临床资料及时停止经验性抗颅内感染治疗,追踪随访28例病例均无细菌性脑膜炎发生,其入颅抗菌药物平均使用时间低于干预前的临床诊断病例,提示神经外科术后脑脊液mNGS检测阴性结果有助于指导神经外科术后细菌性脑膜炎临床诊断病例入颅抗菌药物的使用,且术后脑脊液标本仅需进行细菌DNA检测,在一定程度上也减轻了mNGS检测费用昂贵的缺点。对于有可能因序列数太低所致的假阴性,根据临床特点,可以选择复查。本研究中3例病例因发热、脑脊液糖持续低,初次脑脊液培养和mNGS均阴性,复查脑脊液培养及mNGS检测均阴性,及时停用了抗颅内感染治疗。建议有条件的单位当患者临床表现难以排除颅内感染时,可尽早借助于脑脊液mNGS来综合判断。

本研究第一次在经验性使用抗颅内感染药物前送检脑脊液培养和mNGS检测。采用脑脊液病原学mNGS检测结果指导神经外科术后颅内细菌感染临床诊断病例抗菌药物的使用,后续将纳入更多病例进行研究,为神经外科术后抗菌药物的合理使用提供客观依据。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。