海拔高度对烟叶生长代谢及烤后品质的影响

宋绍森，杨 杰，段旺军，陈思昂，王卫民，张 力，许嘉阳，4，韩 丹，许自成，贾 玮

（1.河南农业大学 烟草学院，河南 郑州 450046；2.四川中烟工业有限责任公司，四川 成都 610011；3.浙江中烟工业有限责任公司，浙江 杭州 310009；4.河南农业大学 资源与环境学院，河南 郑州 450046）

烟草为环境敏感型作物。海拔高度是影响烟叶产质量的重要生态因素之一，海拔高度不同，空气温湿度、光照强度、光照时间、降雨量等生态指标也有所差异[1-4]。研究表明，在一定范围内，随着海拔升高，烟田降雨量增多、日照时数增加、温度降低，达到适宜烟草生长的要求，烟叶农艺性状较为优良，总糖含量升高，糖碱比适宜，化学成分趋于协调，烤烟品质显著上升[5]。但海拔过高时，光照过强、温度过低、昼夜温差大等因素会导致烤烟品质显著下降。甚至有研究发现，同一种植区，海拔高度对烤烟质量的影响显著高于植烟土壤差异造成的影响[6-7]。目前，虽然有相关研究探讨海拔与烟叶品质的关系，但均限于海拔与烤后烟叶质量的关系，尚未有海拔对鲜烟叶品质影响的相关报道。

代谢组学研究始于20 世纪90 年代，由英国伦敦帝国大学NICHOLSON 等[8]提出，是一种研究生命体受外界因素干扰后体内代谢产物水平变化规律的系统生物学。植物代谢组学是代谢组学的一个分支，可用于研究不同环境条件下植物体内次生代谢物的变化特征[9-11]。因其能够直接、准确地反映生物体的生理状态，揭示生命活动机制，近年来在烟草中被广泛应用[12]。如MHLONGO 等[13-14]用植物防御诱导剂刺激烟草细胞，发现脂多糖等植物诱导剂可引起烟草细胞中绿原酸的积累，进一步运用代谢组学方法揭示了植物中产生顺式绿原酸异构体的生物途径。近年来，生态环境对烟叶代谢的影响逐渐受到学者们关注。如LI 等[15]使用代谢组学分析方法分析了河南、云南、贵州3个烟区的烟草差异代谢物及其与气候因子（降雨、日照和温度）的关系。SUN 等[16]采用GC-MS 技术分析了云南玉溪和湖北宣恩2 个烟草品种（翠碧-1 与中烟-100）的代谢谱，论证了不同地区2 个品种的代谢产物差异，并强调了环境和品种对烟叶代谢的影响。尽管越来越多的研究基于代谢组学分析环境因子对烟叶代谢的影响，但罕见有关海拔影响烟叶代谢的报道。因此，采用非靶向代谢组学技术探讨不同海拔高度下烟叶的代谢差异特征，并结合叶片超微结构变化规律，明确海拔因子对烟叶品质形成的影响，为培育优质烟叶提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验供试烤烟品种为YKS-9，供试烟田土壤类型为红壤。海拔1 800 m 处试验地红壤基本理化性质为有效氮含量107.24 mg/kg、速效磷含量38.35 mg/kg、有效钾含量160.03 mg/kg、有机质含量27.32 g/kg，pH 值6.52；海拔2 000 m 处试验地红壤基本理化性质为有效氮含量114.44 mg/kg、速效磷含量36.24 mg/kg、有效钾含量163.04 mg/kg、有机质含量26.02 g/kg，pH值6.42；海拔2 200 m处试验地红壤基本理化性质为有效氮含量122.12 mg/kg、速效磷含量32.07 mg/kg、有效钾含量154.35 mg/kg、有机质含量24.25 g/kg，pH值6.32。

1.2 试验设计

试验于2020年在四川省凉山州会东县进行，选取1 800、2 000、2 200 m 三种海拔高度。试验共设计3 组处理：海拔1 800 m（M1800）、海拔2 000 m（M2000）和海拔2 200 m（M2200）。各海拔地区试验地四周设保护行，每块试验地面积为80 m2。烟株行距为120 cm，株距为0.5 m，每株留叶数为20～22片。各处理的烟草生产管理除试验设计和试验操作的要求外，其他生产管理措施均按照当地优质烟叶生产技术标准执行。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 烟株农艺性状 大田成熟期，从3 个海拔高度各选取10 株代表性烟株，参照YC/T 142—2010《烟草农艺性状调查测量方法》测定农艺性状，指标包括株高、叶片数、茎围、节距、腰叶长和腰叶宽。

1.3.2 烤后烟叶外观质量 待烟叶烘烤、分级后取C3F 档次的烤烟，按照GB 2635—1992 测定方法对烟叶外观质量进行评定。

1.3.3 烤后烟叶常规化学成分 待烟叶烘烤、分级后取C3F 档次的烤烟，采用近红外光谱法检测常规化学成分。

1.3.4 烤后烟叶感官质量 待烟叶烘烤、分级后取C3F档次的烤烟，参照YC/T 530—2015，由评吸专家对其感官质量进行打分评判。

1.3.5 鲜烟叶超微结构 待烟草生长发育至大田成熟期，各处理选取10 株代表性烟株，对从下往上数第10 叶位烟叶进行取样。取样时烟叶样品必须保证尽可能新鲜，1～3 min 完成取样，样品组织大小2 mm×2 mm，尽量薄。将样品组织投入电镜固定液（2.5%戊二醛），用滤纸将样品组织塞进固定液内，不能使其漂浮在固定液表面，4 ℃冰袋保存。

使用0.1 mol/L 磷酸缓冲液（pH 值7.4）漂洗烟叶样品组织后，再进行后固定处理，然后依次放入30%、50%、70%、80%、95%、100%、100%乙醇中进行脱水。完成脱水处理后，依次进行渗透包埋、聚合处理、切片和染色。最后，将铜网盒内干燥的样品放置在透射电子显微镜下进行观察，采集图像。

1.3.6 鲜烟叶代谢组的测定 待烟草生长发育至大田成熟期，各处理选取10 株代表性烟株，对从下往上数第10 叶位烟叶进行取样。使用AB Triple TOF 6600 质 谱 仪 和Agilent 1290 Infinity LC 超 高 压液相色谱仪进行代谢组学试验，取样时避开叶脉，用剪刀剪碎烟叶，迅速放入用液氮预冷的离心管中，将离心管置于干冰中保存运输。将烟叶样本在4 ℃环境下缓慢解冻后，取适量样本加入预冷甲醇/乙腈/水溶液（2∶2∶1，V/V），涡旋混合，低温超声30 min，-20 ℃静 置10 min，14 000×g4 ℃离 心20 min，取上清真空干燥，质谱分析时加入100 μL乙腈/水溶液（1∶1，V/V）复溶，涡旋，14 000×g4 ℃离心15 min，取上清液进样分析。

上清液采用Agilent 1290 Infinity LC 超高效液相色谱系统（UHPLC）HILIC 色谱柱进行分离，样本队列中插入质量控制样品（QC 样品），用于监测和评价系统的稳定性及试验数据的可靠性。对得到的数据，首先进行代谢物结构鉴定、数据预处理，然后进行试验数据质量评价，最后再进行单变量统计分析、多维统计分析、差异代谢物筛选、差异代谢物相关性分析、KEGG通路分析等数据分析。

2 结果与分析

2.1 不同海拔高度对烟株农艺性状和烤后烟叶品质的影响

2.1.1 烟株农艺性状 农艺性状能够直观地反映植物本身的生长状态，整体来看，烟株长势以M2000 处理最好，相较于M2200 处理，株高、叶片数、茎围、腰叶长和腰叶宽分别提高了11.0%、23.0%、5.2%、16.3% 和17.0%（表1）。M2000 和M1800 处理的叶片数、腰叶长和腰叶宽均高于M2200 处理，除M1800 处理株高和茎围显著低于M2000 处理外，M2000 与M1800 处理其余指标差异均不显著。由此可知，M2000 处理烟株农艺性状表现较好，而M1800、M2200处理表现稍差。

表1 不同海拔高度对烟株农艺性状的影响Tab.1 Effect of different altitudes on agronomic traits of tobacco plants

2.1.2 烤后烟叶外观质量 如表2 所示，3 个海拔高度处理的烤烟外观质量几乎相同，仅M2200 处理烤后烟叶身份和油分指标分别表现为稍薄—中等和有—稍有，略差于M1800、M2000处理。

表2 不同海拔高度对烤后烟叶外观质量的影响Tab.2 Effects of different altitudes on appearance quality of flue-cured tobacco

2.1.3 烤后烟叶化学成分 不同海拔高度对烤烟化学成分的影响如表3所示，整体来看，随着海拔高度的升高，烤烟的还原糖、总糖、总烟碱含量均呈先升高后降低的趋势，其中M2000 处理总糖、还原糖、总烟碱的含量最高，显著高于M1800、M2200 处理，M1800 和M2000 处理糖碱比和氮碱比显著低于M2200 处理，糖碱比更接近10，氮碱比在0.8 左右，均处于适宜范围。整体而言，与M1800 和M2200 处理相比，M2000 处理烤烟两糖含量较高、化学成分更加协调。

表3 不同海拔高度对烤后烟叶化学成分的影响Tab.3 Effects of different altitudes on chemical quality of flue-cured tobacco

2.1.4 烤后烟叶感官质量 感观质量是烤烟品质好坏最直观的评判依据，不同海拔高度对烤后烟叶感官质量的影响如表4 所示，总分结果为M2000＞M1800＞M2200，其中M2000 处理的香气量、杂气、柔和度、干燥感、余味得分均高于其他处理，而M1800处理的香气质和细腻度高于M2200 处理。M2000处理C3F 等级烤后烟叶感官质量评价分数较高，烟叶质量较好。

表4 不同海拔高度对烤后烟叶感官质量的影响Tab.4 Effects of different altitudes on sensory quality of flue-cured tobacco

总之，从烟株农艺性状，烤后烟叶外观质量、化学成分和感官质量四方面综合判断，2 000 m海拔处的烟叶质量最好。

2.2 不同海拔高度对鲜烟叶超微结构的影响

液泡是植物细胞特有的细胞器，具有贮藏营养物质、维持细胞渗透压、促进物质交流等多种生理功能。随着海拔的升高，烟叶细胞内的液泡呈现出增大的趋势（图1）。

图1 不同海拔高度下鲜烟叶叶肉细胞亚显微结构（比例尺=20.0 μm）Fig.1 Submicroscopic structure of tobacco leaf mesophyll cells under different altitudes（bar=20.0 μm）

较低海拔高度下，叶绿体贴细胞壁排列且有部分淀粉粒产生（图1a、b），随着海拔高度的不断升高，叶绿体内累积的淀粉粒数目逐渐增多，体积逐渐增大，M2200 处理叶肉细胞内的叶绿体向细胞中间转移（图1b、c）。

如图2a—c 所示，M1800 处理烟叶细胞叶绿体中的基粒片层较多，随着海拔高度升高，叶绿体中嗜锇颗粒体积明显增大。M1800 处理叶绿体的基粒数目较多、类囊体垛叠程度清晰完整，而M2200处理叶绿体基粒片层数与类囊体垛叠程度明显降低，类囊体被膜逐渐降解，结构变得不完整。

图2 不同海拔高度下鲜烟叶叶绿体及线粒体超微结构（比例尺=1.0 μm）Fig.2 Ultrastructure of tobacco leaf chloroplasts and mitochondria under different altitudes（bar=1.0 μm）

海拔高度的升高造成植物细胞内产生更多、更小的线粒体（图2d—f）。高海拔下的植物细胞线粒体和叶绿体逐渐靠近，分布间距变小，甚至出现了线粒体嵌入叶绿体内部的现象（图2e、f）。

2.3 不同海拔高度对鲜烟叶代谢物的影响

2.3.1 总体样本主成分分析（PCA） 从图3 可以看出，正、负离子模式下QC 样本紧密聚集在一起，这说明试验的重复性好，数据可靠。M1800、M2000、M2200 三个处理均处不同象限，间隔较远，表明各组样品间差异显著。

图3 正、负离子模式总体样本的PCA分析Fig.3 PCA analysis of overall samples under positive and negative ion modes

2.3.2 代谢物鉴定 正负离子模式合并后共鉴定到354 种代谢物，其中正离子模式下鉴定到212 种代谢物，负离子模式下鉴定到179 种。各代谢物的化学分类归属信息如图4 所示。鉴定到的代谢物中，有机酸及其衍生物占比最大，达13.559%；其次是有机氧化合物，占比12.147%；之后是脂质及类脂质分子，占比10.452%。

图4 鉴定的代谢物在各化学分类的数量占比Fig.4 The number proportion of identified metabolites in various chemical classification

2.3.3 差异代谢物筛选 经由OPLS-DA（正交偏最小二乘判别分析）模型得到变量权重值（Variable importance for the projection，VIP）。 本 试 验 以OPLS-DA VIP＞1 和P＜0.05 为显著差异代谢物筛选标准。

经数据处理后，共筛选出102 种显著差异代谢物，如图5 所示，M1800、M2200 处理与M2000 处理间分别存在68、56 种差异代谢物。M1800 vs M2000组有18 种特有的差异代谢物，表明这18 种差异代谢物对海拔1 800～2 000 m 变化的响应更为强烈。而M2000 vs M2200 组中特有的差异代谢物仅有3种，表明这3 种差异代谢物对海拔2 000～2 200 m变化的响应更为强烈。而M1800 vs M2200 组中特有差异代谢物有9种，而这9种代谢物在另外2组中变化不显著，表明这些物质是通过缓慢积累来响应海拔高度的变化。整体来看，3 个对比组中有13 种共同差异代谢物，与其他代谢物相比，这13 种代谢物可能更易受到海拔高度变化的扰动。

图5 不同海拔处理间烟叶差异代谢物Venn图Fig.5 Venn diagram of differential metabolites in tobacco leaf treated at different altitudes

2.3.4 差异代谢物鉴定 随着海拔高度的变化，代谢物差异倍数的变化趋势如图6A、B 所示，整体而言，L-天冬酰胺、L-色氨酸、L-组氨酸、烟酰胺、D-脯氨酸、L-谷氨酰胺、2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇、D-葡萄糖酸盐、2，3-二羟基-3-甲基丁酸、莽草酸、间氯硫嘌呤酸、泛酸、胸苷、二氢胸腺素、α-D-葡萄糖、D-来苏糖等代谢物差异倍数大于1，显著上调，表明此类差异代谢物在低海拔（1 800 m）地区相对含量较高。而L-苯丙氨酸、柠檬酸、丙醇二酸、腺嘌呤、鸟苷、奎尼酸、绿原酸、莨菪亭、山奈酚、芸香苷（芦丁）、麦芽糖、蔗糖、D-塔格糖、D-甘露糖、D-阿洛糖、新烟碱等差异代谢物差异倍数小于1，呈显著下调趋势，表明这些差异代谢物在高海拔地区（2 200 m）相对含量较高，在低海拔（1 800 m）地区相对含量较低，且差异显著。

图6 不同海拔处理间烟叶差异代谢物鉴定信息Fig.6 Differential metabolites identification information in tobacco leaf treated at different altitudes

但由图6C—F 发现，随海拔高度的变化，多数物质相对含量变化趋势也会发生改变。如D-甘露糖、D-阿洛糖、D-塔格糖、奎尼酸、琥珀酸盐、L-天门冬氨酸、L-瓜氨酸、D-半乳糖醛酸、L-苏氨酸、D-脯氨酸、2，3-二羟基-3-甲基丁酸等代谢物差异倍数的变化趋势为在M1800 vs M2000 组中显著下调，在M2000 vs M2200 组中显著上调，表明此类差异代谢物相对含量随着海拔升高呈先升后降的趋势。而L-色氨酸、L-异亮氨酸、文多灵碱、异莨菪亭、4-氨基丁酸、3-甲基吲哚、二十碳五烯酸、薰衣草醇等物质的差异倍数则在M1800 vs M2000 组中显著上调，在M2000 vs M2200 组中显著下调，表明其相对含量随着海拔升高呈先降后升的趋势。但也有一些物质在2 组对比中表现出相同的变化趋势，如腺嘌呤和绿原酸，它们的差异倍数在M1800 vs M2000组和M2000 vs M2200组中均呈显著下调趋势。

2.3.5 代谢网络分析 如图7 所示，不同海拔之间的差异代谢物主要集中在氨基酸代谢、半乳糖代谢、果糖和甘露糖代谢、莽草酸代谢、TCA 循环、嘌呤代谢等通路中。在糖类的相关代谢途径中，D-半乳糖酸、D-甘露糖、D-阿洛糖、D-塔格糖的含量随海拔升高呈现先升后降的变化趋势，而D-果糖、蔗糖、乳糖含量则在M2200 处理中升高，果糖含量在M2200 处理升高的原因可能为D-阿洛糖和D-塔格糖的转化，同时，也正因为D-果糖、蔗糖、乳糖含量在M2200 处理中较高，它们的分解产物α-D-葡萄糖含量在M2000 以及M2200 处理中下调的趋势得到缓解；嘌呤代谢中，L-谷氨酰胺含量随海拔升高急剧下降，鸟嘌呤、腺苷含量急剧上升，这也是一种受海拔高度影响的较为直接的转化关系。根据烤烟品质以及超微结构的变化趋势综合考量发现，烤烟品质也是随海拔的升高呈现出先升后降的趋势，在海拔2 000 m处最优。因此，α-D-葡萄糖、D-半乳糖酸、D-甘露糖、D-阿洛糖、D-塔格糖等糖类物质，莽草酸、奎尼酸、琥珀酸等有机酸，苯丙氨酸、丙氨酸、脯氨酸等氨基酸，这些差异代谢物含量的变化趋势与烟株品质变化趋势较为一致或完全相反，表明这些差异代谢物在受到海拔因素调控的同时，也较易受到烟株自身代谢系统的调控，且该类物质可能与烟株品质密切相关。值得注意的是，苯丙氨酸与脯氨酸含量虽先升后降，但与M1800 处理相比，M2200 处理仍有上调趋势。随着海拔高度的升高，蔗糖、乳糖、D-果糖、组氨酸、L-谷氨酰胺、鸟苷、腺嘌呤等物质的含量递增或递减，表明此类物质可能对海拔变化的响应更为强烈，其含量与海拔高度直接相关。

图7 不同海拔高度下烟叶差异代谢物的网络分析Fig.7 Network analysis of differential metabolites in tobacco at different altitudes

2.3.6 KEGG 途径富集分析 根据农艺性状以及代谢物特征结果发现，M2000 处理烟株长势最好，3 种不同海拔高度烟株的烤后烟叶品质整体呈先升后降的趋势。因此，以M1800 vs M2000 和M2000 vs M2200 两组对比为主进行数据分析，对筛选出的差异代谢通路进行差异丰度得分比较（图8）。M1800 vs M2000对比下共筛选出27个代谢通路，而M2000 vs M2200 对比下仅筛选出18 个代谢通路。其中氨基酸代谢相关通路中，2 个对比组均有6 条代谢通路，但随着海拔高度上升，除缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成代谢通路的表达趋势无明显变化，色氨酸代谢通路的表达呈先降后升趋势外，其余氨基酸代谢通路的表达均呈先升后降的趋势；碳水化合物代谢途径中，仅半乳糖代谢和丙酮酸代谢的表达随海拔升高呈先升后降的趋势，其余碳水化合物代谢途径的表达趋势均表现为在海拔1 800～2 000 m 显著上升，在海拔2 000～2 200 m 无显著变化；脂质代谢、膜运输、辅助因子和维生素的代谢、其他氨基酸的代谢、翻译等代谢途径中，除不饱和脂肪酸的生物合成、β-丙氨酸的代谢以及氨酰基-tRNA 的生物合成3 种代谢通路的表达在海拔1 800～2 000 m 随海拔升高而下降，在海拔2 000～2 200 m处无显著差异外，其余代谢通路均表现出先升后降，或先无显著变化后降低的表达趋势。整体而言，在海拔1 800～2 000 m下，随高度升高，烟株代谢通路的表达多呈现升高的趋势；而在海拔2 000～2 200 m，随高度升高，烟株代谢通路的表达多数为降低趋势。

图8 所有差异代谢通路的差异丰度得分Fig.8 Differential abundance score of all the differential metabolic pathways

3 结论与讨论

3.1 海拔高度对烟草品质的影响

整体而言，不同海拔处理烤烟的农艺性状、外观质量、化学质量、评吸质量指标表现为M2000＞M1800＞M2200，随着海拔高度的增加，烤后烟叶品质呈先升高后降低的趋势。这一变化规律与魏国平等[4]、李雪芳等[5]的研究结果一致，均表现为在某一海拔高度区间内，随着海拔的升高，烤烟产质量先升后减。其主要原因在于烟草种植的海拔高度不同，烟株生长发育所处气候环境不同，环境温湿度、光照强度、光照时间等生态指标随之改变，在适宜的海拔高度下，烟株生长的环境条件良好，农艺性状较为优良，烤烟品质显著上升。但当海拔过高时，高海拔地区的天气变化会使烟草遭受冷胁迫，损害烟叶的产质量。LI等[17]发现，海拔2 450 m以上的烟草种植区，昼夜温差突变（日气温下降20 ℃以上）和降雨会对大田种植烟草造成冷胁迫；而OVERSTREET 等[18]研究表明，冷胁迫会降低鲜烟叶的品质。在海拔高度的变化过程中，光照强度、辐射、温度等环境因素的变化可能是调控烟草内部代谢，影响烤后烟叶最终品质的关键因素。

3.2 海拔高度对烟叶超微结构的影响

本研究表明，随着海拔的升高，烟叶细胞内的液泡体积变大，淀粉粒数目逐渐增多，但是叶绿体片层数和类囊体垛叠程度降低，而夏春等[19]发现，随着液泡面积增大，植物细胞中叶绿体等细胞器数量减少，与本研究结论一致。说明高海拔地区对烟株产生了一定的非生物胁迫，促使烟叶细胞改变其自身结构来抵御此类胁迫。

海拔高度过高时，会对植物产生低温、强辐射等胁迫效应，淀粉粒的积累是高海拔植物对低温环境的一种适应性表现，随着海拔高度的升高，叶绿体内累积的淀粉粒数目逐渐增多，体积逐渐增大；海拔高度过高时，强辐射等胁迫效应促使叶绿体的基粒片层数和类囊体垛叠程度在膜结构的降解下逐渐降低，结构被破坏[20]。叶绿体片层数减少、片层垛叠程度降低也可能是叶肉细胞在高海拔地区的适应性变化，这种变化能有效地降低植物的光捕获能力，从而保护叶绿体免受捕获过多光能所造成的伤害[21-22]。本研究中，在2 200 m 高度下，叶肉细胞内的叶绿体向细胞中间转移，这可能是由于高海拔下，紫外辐射较强，光能相对丰富甚至过剩，叶绿体位置内移甚至在细胞中央分布，可以有效地减少光线的直接穿透，避免强辐射的灼伤；海拔高度的升高造成植物细胞内产生更多、更小的线粒体，低CO2分压下生长的高山植物通过增加线粒体数目、缩小线粒体体积从而扩大内膜系统来提高植物的呼吸速率，保证植物即使处于极端环境中，也有正常的能量供应。以上这些变化都是植物对高海拔环境的一种有效适应。王玉萍等[23]发现，珠芽蓼叶片中嗜锇颗粒与淀粉粒的数目随海拔升高而增加，而叶绿体基粒数目和类囊体垛叠程度均随海拔升高呈现先升后降的趋势，与本研究结论基本一致。

本研究中，高海拔下的植物细胞线粒体和叶绿体逐渐靠近，分布间距变小，甚至出现线粒体嵌入叶绿体内部的现象。这种“零接触”现象作为植物适应高海拔条件的特殊生存方式，是为了缩短两者之间代谢物质、能量和气体的运输和交换距离，提高植物物质与能量利用的有效性[24]。

3.3 海拔高度对烟叶代谢物的影响

差异代谢物分析结果表明，除α-D-葡萄糖、D-来苏糖以外，多数糖类物质以及山奈酚、芸香苷、莨菪亭等多酚类香气物质的相对含量随着海拔升高呈显著上升趋势；而多数氨基酸类化合物的相对含量随着海拔的升高呈显著下降趋势。结合代谢网络分析与KEGG 富集途径分析发现，多数糖类代谢通路、氨基酸的生物合成代谢通路的表达及其相关代谢物相对含量的变化均呈先升后降趋势，如D-脯氨酸、丙氨酸参与的丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢途径，莽草酸、奎尼酸参与的莽草酸代谢途径（苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成）以及D-半乳糖酸、D-甘露糖、D-阿洛糖、D-塔格糖参与的相关糖类代谢途径，这些差异代谢物的含量及其所在的代谢通路表达趋势在海拔1 800～2 000 m 升高的原因可能是，在适宜的海拔高度会促进烟草的生长发育，使烤烟烟叶内含物增多，化学成分更加协调，而在海拔2 000～2 200 m，因海拔高度过高，气温较低，光照过强，烟株部分生理代谢功能受到抑制，此时，烟株体内会产生一系列的变化来应对外界环境胁迫，如产生嘌呤类物质以缓解辐射胁迫，增加糖类物质以及部分氨基酸的积累以缓解冷胁迫[25]。

蔗糖可被水解为葡萄糖和果糖，为植物生理代谢功能运转提供能量，其含量增加是植物在逆境中生长发育的基础。在植物应对强辐射胁迫的过程中，核苷类物质扮演着重要角色，过强的紫外线照射可使DNA 分子中同一条链两相邻的胸腺嘧啶碱基之间形成二聚体，影响DNA 的双螺旋结构，使其复制和转录功能均受到阻碍，故胸苷、二氢胸腺素的相对含量因海拔过高而下降；而腺嘌呤是维持生物体代谢功能的必要成分，鸟苷的重要组成部分之一鸟嘌呤则对紫外线有强烈的吸收性，故两者含量随着海拔高度升高而升高。

植物遭受冷胁迫时，苯丙氨酸不但是多酚类物质生成的重要前体物，在寒冷条件下还可激活植物体内活性氧清除系统来提高植物自身的耐寒性[26]。随着海拔高度的改变，多数氨基酸相对含量在2 200 m 处下调，而L-苯丙氨酸相对含量在代谢网络图中海拔2 200 m 处较高，可能与植物抵御冷胁迫的机制有关。而苯丙氨酸经过苯丙烷途径的降解，其转化生成的多酚类物质也随海拔升高而升高。多酚类物质对植物生长和植物防御机制至关重要，同时也是烟草中重要的香味物质，很大程度上影响着烤烟的香吃味。大量研究表明，酚类物质往往具有抗氧化能力，多酚的积累可以保护细胞免受低温应激产生自由基所引起的氧化损伤[27-28]，SUN等[16]研究表明，烟叶中多酚含量主要受温度和阳光照射的影响，与温度呈负相关。本试验发现，奎尼酸、绿原酸、莨菪亭、山奈酚、芸香苷（芦丁）等多酚类物质相对含量随海拔升高而升高，该结论与此前报道[29-30]基本一致。

综上，根据烤烟质量评价结果以及代谢组学鉴定结果综合考量发现，随海拔升高，凉山会东烟区烟株品质整体呈现先升后降的趋势，以海拔2 000 m处的烤烟品质最好，海拔升高至2 200 m 处烤烟品质较差；随海拔升高，烟叶细胞内液泡体积增大，线粒体数目增多，叶绿体内淀粉粒数目增多，体积增大，但叶绿体片层数和垛叠程度减少，线粒体与叶绿体间开始出现“零接触”现象；氨基酸代谢、糖类代谢、莽草酸代谢途径发生显著变化，在响应海拔高度变化的过程中起着关键作用。