KLF10在多发性骨髓瘤患者中的表达及与预后的关系*

李慧 张吴霞 熊烨

(四川大学华西医院1.层流研究病房;2.临床试验中心;3.肿瘤科,四川 成都 610044)

多发性骨髓瘤是一种浆细胞异常增殖的恶性肿瘤,其主要特征为免疫失调、骨痛、骨损伤、肾功能衰竭、骨质破坏、细菌性感染等[1-2]。多发性骨髓瘤是常见的血液系统肿瘤,约占所有恶性肿瘤的1%,约占所有血液系统恶性肿瘤的10%[3-4]。锌指蛋白转录因子10(KLF10)是KLFs家族的亚型之一,KLFs家族与多种肿瘤的发生发展密切相关,例如前列腺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌等[5]。KLF10作为转录因子,调节基因转录,细胞增殖、分化,细胞周期,在多种肿瘤中有重要作用[6]。目前为止,多项研究证实了微小RNA-21(miR-21)与多发性骨髓瘤的发生发展及预后密切相关[7]。迄今,尚缺乏KLF10和miR-21共同在多发性骨髓瘤中的研究报道。因此,本研究通过测定KLF10和miR-21在多发性骨髓瘤患者血清中的表达,探究其与预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取我院在2015年1月—2017年1月收治的多发性骨髓瘤患者126例作为观察组,另选取同期在我院进行健康体检的健康者120例作为对照组。观察组男性65例,女性61例,平均年龄为(60.50±10.52)岁;对照组男性59例,女性61例,平均年龄为(59.85±9.26)岁。收集受试者临床资料,包括免疫球蛋白分型、Durie-Salmon(DS)分期、重度贫血、美国东部肿瘤协作组体力状况(ECOG)评分、骨髓浆细胞比例等。纳入标准：①诊断符合中国多发性骨髓瘤诊断指南(2022年修订)[8]。②患者初次诊断为多发性骨髓瘤。③患者、家属知情同意。排除标准：①已接受其他治疗,例如免疫疗法等。②患者伴有其他心血管、急慢性感染或者其他恶性肿瘤等。③患者伴有精神疾病,无法配合治疗者。本研究通过我院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 样本采集 采集观察组患者确诊次日清晨空腹静脉血和对照组体检者当日的空腹静脉血5 mL,离心机以4000 r/min离心10 min,分离血清。血清保存在-80 ℃冰箱待测。

1.2.2 主要仪器和试剂 KLF10酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(货号：XG-H95904)购自上海西格生物科技有限公司,TRIzol试剂(货号：15596026)购自苏州瑞诺德生物科技有限公司,反转录试剂盒(货号：205311)购自苏州瑞诺德生物科技有限公司,荧光定量PCR试剂盒(货号：CR0222)购自赛尔瑞成(北京)生命科学技术有限公司,qRT-PCR仪(型号：MF048-s-01)购自广州市智取生物科技有限公司。

1.2.3 ELISA检测血清KLF10水平 采用KLF10 ELISA试剂盒检测受试者血清KLF10水平,操作步骤严格按照ELISA试剂盒说明书进行。

1.2.4 qRT-PCR检测血清miR-21表达水平 使用TRIzol法提取血清中总RNA,采用逆转录试剂盒将RNA反转录为cDNA(反转录反应体系：总RNA 2 μL、RNase Free dH2O(20 μL)、PrimeScript RT Master Mix(4 μL))后进行qRT-PCR反应,qRT-PCR检测条件：95 ℃预变性5 min循环1次,95 ℃变性30 s、55 ℃退火45 s,75 ℃延伸15 s,共循环35次。以U6为内源对照,以2-ΔΔCt的方法计算miR-21的表达水平。引物由上海烜雅生物科技有限公司合成,引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3 随访 对多发性骨髓瘤患者术后进行为期5年的随访。随访方式为电话随访或复诊,随访内容为患者生存情况。随访终止时间为2022年1月,随访终点为患者死亡或到随访结束。

2 结果

2.1 两组血清KLF10、miR-21表达水平 观察组血清KLF10水平低于对照组,血清miR-21水平高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05),见表2。

表2 两组血清KLF10、miR-21表达水平

2.2 观察组血清KLF10、miR-21表达相关性 Pearson分析显示,观察组血清KLF10与miR-21水平呈负相关(r=-0.447,P<0.05)。见图1。

图1 KLF10与miR-21表达相关性分析

2.3 血清KLF10、miR-21表达与多发性骨髓瘤患者临床病理特征的关系 多发性骨髓瘤患者血清KLF10中位值为26.26 ng/mL,miR-21的中位值为1.34。KLF10≥26.26 ng/mL为高表达,<26.26 ng/mL为低表达;miR-21≥1.34为高表达,<1.34为低表达。分析结果表明,多发性骨髓瘤患者血清KLF10、miR-21水平与患者性别、年龄、免疫球蛋白分型无关(P>0.05),与患者DS分期、是否重度贫血、ECOG评分以及骨髓浆细胞比例有关(P<0.05)。见表3。

表3 KLF10、miR-21水平与多发性骨髓瘤患者临床病理特征的关系[n(×10-2)]

2.4 血清KLF10、miR-21水平与多发性骨髓瘤患者预后的关系 5年随访结果显示,126例多发性骨髓瘤患者死亡49例,生存77例,总生存率为61.11%。

血清KLF10低表达组死亡33例(52.38%),生存30例(47.62%);血清KLF10高表达组死亡16例(25.40%),生存47例(74.60%)。血清miR-21低表达组死亡15例(23.81%),生存48例(76.19%);血清miR-21高表达组死亡34例(53.97%),生存29例(46.03%)。Kaplan-Meier生存曲线表明,多发性骨髓瘤患者血清KLF10低表达组生存率低于高表达组(χ2=9.651,P=0.032);血清miR-21高表达组生存率低于低表达组(χ2=12.056,P=0.0024)。见图2。

图2 Kaplan-Meier生存曲线分析KLF10、miR-21与多发性骨髓瘤患者预后的关系

2.5 Cox回归分析影响多发性骨髓瘤患者预后的因素 以多发性骨髓瘤患者生存状态为因变量(死亡=1,存活=0),以患者血清KLF10水平(低表达=1,高表达=0)、miR-21水平(高表达=1,低表达=0)、DS分期(Ⅲ期=1、Ⅰ～Ⅱ期=0)、是否重度贫血(有=1,无=0)、ECOG评分(>3分=1,≤3分=0)以及骨髓浆细胞比例(>30%=1,≤30%=0)为自变量进行COX回归分析。单因素COX回归分析显示,血清KLF10低表达、血清miR-21高表达、DS分期Ⅲ期、重度贫血、ECOG评分>3分和骨髓浆细胞比例>30%均为影响多发性骨髓瘤患者发生不良预后的危险因素(P<0.05)。多因素COX回归分析结果显示,血清KLF10低表达、血清miR-21高表达、DS分期Ⅲ期、重度贫血、ECOG评分>3分和骨髓浆细胞比例>30%是影响多发性骨髓瘤患者发生不良预后的危险因素(P<0.05)。见表4。

表4 COX回归分析影响多发性骨髓瘤患者预后的危险因素

3 讨论

多发性骨髓瘤是一种骨髓浆细胞恶性增殖的血液系统恶性肿瘤,可引起多种脏器功能损伤[9-11]。多发性骨髓瘤的主要临床症状为骨痛、骨质疏松、贫血、感染、肾功能衰竭等[12-14]。随着对多发性骨髓瘤的深入研究,以及治疗策略改善、开发新药等,多发性骨髓瘤患者生存期明显提升,但由于其异质性、耐药性、易复发等特点,目前其死亡率、复发率依然较高,且多发性骨髓瘤仍无法治愈,严重影响患者生活质量[15-16]。多发性骨髓瘤的具体发病机制尚不完全清楚,可能与电离辐射、感染、遗传因素等多种机制有关[17]。

KLFs家族有17种亚型,其成员的异常表达与多种实体瘤、血液瘤关系密切,参与了癌细胞的增殖、分化、侵袭、转移等过程[18]。KLF10属于KLFs家族,是一种肿瘤抑制因子,具有调节癌细胞增殖、凋亡和炎症反应等功能,在抑制癌细胞增殖、促进癌细胞凋亡中起重要作用[19]。有研究表明,在多发性骨髓瘤中KLF10低表达[20]。Lin等[21]研究发现,KLF10在胃癌中呈低表达,可作为胃癌的独立预后因素。Yeh等[22]最近研究发现,KLF10在口腔鳞状细胞癌中低表达,可作为其独立预后因素。miRNA是一类内源性非编码微小RNA,长度在18～25个核苷酸,在机体组织分化、免疫及各种疾病的调控中具有重要作用[7]。miR-21是miRNA的一种,在多种生物学功能中发挥作用,例如免疫反应、骨骼再生、成骨分化、癌症等[23]。Handa等[24]研究发现,多发性骨髓瘤外泌体中miR-21呈高表达,促进骨髓瘤细胞的发展。还有研究发现,多发性骨髓瘤患者浆细胞中miR-21呈高表达,促进了肿瘤发展[25]。本研究结果显示,观察组血清KLF10水平低于对照组,血清miR-21水平高于对照组,提示二者参与了多发性骨髓瘤的发生发展过程。Pearson相关性分析显示,观察组血清KLF10与miR-21水平呈负相关,提示miR-21可能通过负向调控KLF10的表达在多发性骨髓瘤中发挥作用。分析血清KLF10、miR-21水平与患者临床病理特征的关系发现,多发性骨髓瘤患者血清KLF10、miR-21水平均与患者DS分期、是否重度贫血、ECOG评分以及骨髓浆细胞比例有关,进一步提示二者与多发性骨髓瘤的发生发展有密切关系,下一步可开展实验验证二者关系,为多发性骨髓瘤的治疗提供新思路。Kaplan-Meier生存曲线分析表明,多发性骨髓瘤患者血清KLF10低表达组生存率低于高表达组,血清miR-21高表达组生存率低于低表达组。多因素COX回归分析显示,血清KLF10低表达、血清miR-21高表达、DS分期Ⅲ期、重度贫血、ECOG评分>3分和骨髓浆细胞比例>30%是影响多发性骨髓瘤患者发生不良预后的危险因素,提示血清KLF10、miR-21表达具有评估多发性骨髓瘤患者预后的作用,临床可通过监测患者血清KLF10、miR-21水平,合理制定治疗方案,提高患者生存期和生活质量。

4 结论

多发性骨髓瘤患者血清KLF10表达下调,miR-21表达上调,二者表达水平与患者临床病理特征相关,且二者是多发性骨髓瘤患者发生不良预后的危险因素,与多发性骨髓瘤的发生发展密切相关。后续研究将扩大样本量,深入探究二者相互作用关系以及多发性骨髓瘤的发病机制,为临床治疗提供依据。