改良型富血小板纤维蛋白促进脂肪移植存活的最适混合比例实验研究*

刘翔宇 彭海涛 尹海林 田超 文银亭 贺红林 丁娜 袁怡君 李均

(川北医学院第二临床医学院·南充市中心医院1.烧伤整形美容外科;2.妇科,四川 南充 637000)

百年前自体脂肪移植(Autologous fat transplantation,ADSCs)就已应用于临床[1],其临床应用常因脂肪组织移植块缺血坏死及感染等因素而受到限制。吸脂术于上个世纪80年代问世,研究发现颗粒脂肪较块状脂肪的移植成活率大大提高[2]。Zuk等[3]于2001年首次详细描述了ADSCs用于临床的治疗潜能,并推测其可能是一种改善皮肤结构的方法。自体颗粒脂肪具有广泛的来源、极小的排斥反应、自然的外观、柔软的手感等特点,是理想的软组织填充物。因此,自体脂肪移植术成为目前应用最广泛的整形美容外科技术之一[4]。但脂肪细胞移植的结果不可预料且多变,其移植后易吸收、存活率低且不稳定仍是严重制约脂肪移植技术开展的主要原因[5-6]。富血小板纤维蛋白(Platelet-rich fibrin,PRF)作为富血小板血浆(Platelet-rich plasma,PRP)之后的新一代浓缩血小板血液制品,多项研究证实PRF持续释放多种生长因子的时间长达4周[7-9]。据相关研究报道,富血小板纤维蛋白与自体脂肪颗粒的比重从1：2到1：25不等,跨度大且均有促进效果[10-12]。有学者通过实验发现在移植术后的8到12周移植的脂肪颗粒与机体逐渐建立血供,而在12周以后将生成较为成熟的血管;且当上述比重达到1：10时,PRF促进脂肪移植物存活的效果达到最佳,1：5及1：15亦有一定的促进效果但都不及1：10[13]。在2014年Ghanaati等[14]降低了离心转速并增加了离心时间,制成了改良型富血小板纤维蛋白(Advanced Platelet-rich Fibrin,A-PRF),避免了较大的离心力使血小板及白细胞的生物结构遭到破坏,解决了PRF制备中发生的离心力过大导致部分WBC、PLT及各成分分布不均的不足,提高了A-PRF促进再生的潜能。近来有研究表明A-PRF在提高脂肪细胞存活率、减少炎症因子作用及增加毛细血管生成率等方面均优于PRF[15]。本实验拟研究A-PRF促进脂肪移植物存活的最佳混合比例,达到脂肪存活率的最大化,以保证在损耗最小的情况下最大化发挥脂肪及血液等组织的作用并取得预期的临床疗效。

1 材料与方法

1.1 样本来源 本研究的脂肪组织及血液样品都来自于2021年12月—2022年2月在南充市中心医院整形美容外科行腹部抽脂术的患者。准入条件：年龄25～35岁,身体健康,无既往病史,半年来无影响实验的长期药物服用病史。样本的获取均告知并取得患方同意并签字确认。

1.2 实验动物 6周龄雌性SPF级BALA去胸腺裸鼠(下文称“裸鼠”),购于川北医学院动物实验中心,饲养于SPF环境中,所有实验操作按川北医学院动物实验中心要求进行。本研究通过川北医学院伦理委员会审核通过(伦理号：NSMC[2021]139号)。

1.3 实验试剂 胎牛血清、I型胶原酶、F12培养基、裂红素、双抗(链霉素、青霉素)、0.25%胰蛋白酶购自BI公司,苏木素染液、伊红染液、无菌磷酸盐缓冲液(PBS)、6孔细胞培养板购自于美国Corning公司,0.5%戊巴比妥钠溶液由川北医学院动物实验中心配制提供。

1.4 实验方法

1.4.1 制备移植物 ①患者取平卧位,予以全身麻醉,消毒铺巾,以利多卡因肿胀溶液进行腹部肿胀麻醉满意后将3 mm直径的抽脂针头与30 mL的空针注射器相连接,手动于腹壁脂肪层进行放射状分层抽吸,得到混合抽取物,无菌生理盐水多次冲洗至无明显血液,挑除纤维组织及肌肉组织,将处理好的脂肪组织装至注射器内备用。②在患者肘上5 cm处绑上压脉带,肘窝消毒,标记并于正中静脉抽取血液,采集20 mL血液于无菌真空静脉采血管中并立即以1500 r/min,离心14 min,得到的A-PRF凝胶静置于静脉采血管中。③从采血管中提取A-PRF凝胶并切碎,分别按A-PRF与脂肪的体积比为1：6、1：8、1：10、1：12、1：14将上述凝胶加入脂肪移植物中并充分混匀,分别装于1 mL注射器中待用;另取仅含脂肪颗粒分装于1 mL注射器中待用。

1.4.2 ADSCs分离培养及划痕实验 预热摇床至37 ℃,将20 mL脂肪组织于超净台中转移至50 mL离心管中,加入2 mL 0.1% Ⅰ型胶原酶混合均匀,将混合好的脂肪组织置于37 ℃恒温摇床中震荡40 min,40 min后取出离心管于超净台中加入10 mL胎牛血清终止消化,加入2 mL裂红素静置3 min,置于26 ℃离心机内1000 r/min,离心10 min,丢弃上清液,将 F12完全培养基(其中含有体积分数为10%的胎牛血清,1%青霉素-链霉素)加入其中重悬细胞沉淀后接种至培养瓶,将培养瓶放置于37 ℃恒温,5%CO2的培养箱内进行培养,待细胞融合至80%以上后传代,取第三代ADSCs加入1 mL 0.25% 胰酶37 ℃消化、完全培养基终止消化、1500 r/min离心10 min,用无血清的F12培养基将细胞团制成细胞悬液,第三代ADSCs以1×106个/孔的密度接种于6孔细胞培养板中,当细胞爬满后,以200 μL移液管尖于培养板底层的细胞划出一条水平的无细胞的空白区域,用PBS洗涤两次,以1：6、1：8、1：10、1：12、1：14为浓度梯度于每孔加入A-PRF凝胶,分别记为1：6、1：8、1：10、1：12、1：14组,放入37 ℃,5%CO2培养箱内于0、48、72 h分别于显微镜下观察细胞迁移率并记录。迁移面积=(培养48、72 h的迁移面积-培养0 h的迁移面积)/培养0 h的空白面积。

1.4.3 随机分组 随机将60只6周龄SPF级雌性裸鼠分为5个组,每组12只,分组后将裸鼠以12只/笼饲养于23 ℃、昼夜12 h/12 h、自由进食及饮水的SPF环境中,饲养一周后进行建模。具体如下：裸鼠称重,每只裸鼠腹腔以50 mg/kg注射为0.5%的戊巴比妥钠溶液,75%的酒精将裸鼠背部皮肤消毒3次,铺无菌单,1 mL的空针注射器连接注脂针,以多点、多层次、多方向注射的方式在术区分别均匀注射0.2 mL A-PRF与颗粒脂肪的混合物(A-PRF与脂肪的体积比为1：6、1：8、1：10、1：12、1：14),分别记为1：6、1：8、1：10、1：12、1：14组。

1.4.4 测量体积保留率及质量保留率 在移植后的第4、8、12周,每组以断颈法处死3只裸鼠,裸鼠臀部皮肤以75%酒精消毒3次,铺无菌单,于脊柱中线做竖直切口并全层掀起裸鼠皮肤,以血管钳逐层钝性分离到移植物附近,将移植物连同包膜完整取出。将样本放置于1 mL注射器甲中,以注射器甲抽取1 mL生理盐水,使用注射针头将注射器甲内的生理盐水推入到1 mL的注射器乙中,读取注射器乙内的生理盐水量,该样本的体积=1 mL-注射器乙内生理盐水体积,反复测量3次,最终取平均值。体积保留率=移植物取出后的体积/移植物植入前的体积 ×100%。质量保留率：以精密电子天平称重并记录下样本取出后即刻的质量,反复测量3次,最终取平均值。质量保留率=移植物取出后的质量/移植物植入前的质量×100%。

1.4.5 脂肪移植物染色 将取出的脂肪移植物完成质量及体积测量后迅速置于体积分数为10%的甲醛溶液中固定,将标本24 h脱水、修剪、浸蜡、包埋、切片、行苏木精-伊红染色、封片,最后镜检。根据结构完整性、囊腔/空泡的占比、炎症反应程度、间质纤维化程度这四个指标以0～5分进行评分：0分为无,1分为轻度,2分为轻度至中度,3分为中度,4分为中度至重度,5分为重度。在每个镜下视野均行3次打分取其均值,最终计算出5个镜下视野的均值。CD31 染色各组脂肪组织切片,统计100倍镜下视野下的血管总数,选取十组不同视野下的血管数,计算其血管密度,比较移植后血管生长情况。采用Halo数据分析系统分析出各图像中阳性面积所占比例。其中蓝色代表苏木素染细胞核,而棕黄色代表DAB中的阳性表达。

2 结果

2.1 5组细胞迁移率比较 第24小时5组细胞迁移率变化均不明显;第48小时1：12组的细胞迁移率明显大于其他4组(P<0.05);第72小时1：12组的细胞迁移率明显大于其他各组,1：10组与1：14组的迁移率比较差异无统计学意义(P>0.05);1：12组的迁移率与其他各组相比差异具有统计学意义(P<0.05),见图1及表1。

表1 5组细胞迁移率

图1 5组细胞迁移率

2.2 5组裸鼠脂肪组织体积保留率比较 在移植后第4周,1：12组的体积保留率明显高于其他4组(P<0.05);在移植后第8周,1：10组、1：12组、1：14组的体积保留率明显高于1：6组、1：8组,1：10组与1：14组相比差异无统计学意义(P>0.05),1：12组的体积保留率最高,与其他各组相比差异有统计学意义(P<0.05);在移植后的第12周,1：10组、1：12组、1：14组的体积保留率明显高于1：6组、1：8组,1：10组与1：14组体积保留率相比差异无统计学意义(P>0.05),见表2。

表2 5组体积保留率

2.3 5组裸鼠脂肪组织质量保留率比较 在移植后第4周,1：10组、1：12组的质量保留率明显高于1：6组、1：8组、1：14组,1：12组的质量保留率与其他4组差异具有统计学意义(P<0.05);在移植后第8周,1：12组、1：14组的质量保留率明显高于1：6组、1：8组、1：10组(P<0.05),1：12组的质量保留率与其他4组相比差异具有统计学意义(P<0.05);在移植后第12周,1：10组、1：12组与1：14组质量保留率均明显优于1：6组、1：8组,1：12组的质量保留率与其他4组相比差异具有统计学意义(P<0.05),见表3。

表3 5组质量保留率

2.4 5组裸鼠脂肪组织HE染色结果及评分 HE染色结果显示,1：12组的结构完整性与其他组无明显差异,囊腔/空泡占比、炎症反应程度、间质纤维化程度均优于其他4组,见图2。将总标本按照取材时间分为4、8、12周组,与8周组相比,12周组脂肪组织病理评分略微降低,但差异不显著(P>0.05),与4周组相比,12周组脂肪组织病理评分明显降低(P<0.05);8周组脂肪组织病理评分有所降低(P<0.05),见表4。提示4周组脂肪组织病理改变程度相对较重,8周组和12周组脂肪组织病理改变程度均相对较轻,可见脂肪移植物于移植后第8周已经趋于稳定。

表4 脂肪组织病理评分分)

图2 5组脂肪组织HE染色(200×)

2.5 5组CD31染色结果 与1：6组相比,1：12组人脂肪组织CD31蛋白含量明显升高(P<0.05),1：8组、1：10组、1：14组人脂肪组织CD31蛋白含量均无明显变化(P>0.05)。与1：8组相比,1：12组人脂肪组织CD31蛋白含量明显升高(P<0.05),1：10组、1：14组人脂肪组织CD31蛋白含量均无明显变化(P>0.05);与1：10组相比,1：12组人脂肪组织CD31蛋白含量明显升高(P<0.05),1：14组人脂肪组织CD31蛋白含量无明显变化(P>0.05);与1：12组相比,1：14组人脂肪组织CD31蛋白含量明显降低(P<0.05), 见图3、表5。

表5 CD31阳性面积占比

图3 5组脂肪组织CD31染色结果(40×)

3 讨论

自体脂肪移植会对组织增大产生持续的影响,因此,脂肪组织被整形外科医师认为是理想的软组织填充物。由于脂肪组织具有数量巨大、便于收集、机体损害小、不易过敏等优点,自体脂肪移植成为美容和组织重建手术中常用的治疗手段,常用于修复软组织缺损、面部年轻化和隆胸等[16-17]。然而脂肪移植的结果多种多样且依赖于术者的技术[18-19]。最近的研究表明,早期移植物中新生血管的生成在提高移植组织的质量和体积保留中起着关键作用[20]。通过收集患者自己的血液,离心将其制备成血小板浓缩物有望解决脂肪移植物存活率低下的问题。

PRP作为最早的富集血小板血液制品[21]。据相关研究表明,PRP通过刺激增加多种血管生成因子的产生来调节和激活内皮细胞的迁徙,从而刺激生成新生血管来提高移植物的存活率[22]。PRF被称为第二代富集血小板血液制品,据报道其许多方面都优于PRP[8,20-24]。PRF制备较PRP简单,只需一个离心步骤,其不需要添加外源性抗凝物质来促进纤维蛋白的自然聚合。PRF在离心的过程中形成了一种高密度且结构均一的三维立体纤维蛋白结构,此结构有利于血小板与细胞因子结合及组织细胞迁徙和生长,具有良好的抗炎和促再生修复作用。PRF内部形成纤维蛋白支架,血小板、白细胞及其相应的细胞因子以及血浆内的其他成分均以纤维蛋白支架为载体吸附其上,其特殊结构使得细胞因子的释放时间显著延长至28天,对脂肪移植物的作用时间较PRP明显延长。Kobayashi等[7]研究发现A-PRF释放的生长因子数量明显高于PRF和其他亚型的PRF,认为调整离心参数增加了A-PRF含有的细胞量,特别是其中白细胞的数量,其内有更多的白细胞相关的成分,而各类细胞及生长因子的来源之一正是白细胞。常尧仁[25]发现A-PRF的立体网状结构松散、空间网格大、交联程度低,因此A-PRF的纤维蛋白网中存在更多的免疫细胞。柳芳等[15]将脂肪颗粒分别添加PRF及A-PRF后移植于兔的背部,发现A-PRF在提高脂肪细胞存活率、降低炎症反应及促毛细血管生成等方面均强于普通型PRF。

脂肪和血液等组织都是弥足可贵的临床资源,A-PRF广泛用于临床的首要条件是明确其促进脂肪移植物存活的最适浓度。在相关研究中,混合比例不尽相同,但每制备1.5～4 mL A-PRF就需要10～20 mL静脉血液,进行大量脂肪填充时需要消耗大量血液来制备A-PRF。因此,我们急需找到A-PRF能提高移植脂肪存活率的最适混合占比。本研究结合已有的实验结果,尝试采用细胞迁移率、质量及体积保留率、新生血管生成、间质化纤维程度及CD31蛋白表达率等参数来评估脂肪移植物的存活情况。在进行体外脂肪移植实验时使用了免疫缺陷小鼠作为移植载体,分析并比较了1：6、1：8、1：10、1：12、1：14五个混合占比来进行实验。结果表明,1：12混合比例对脂肪移植物存活的促进效率最高。免疫组化显示1：12混合比例组脂肪标本的囊腔/空泡占比、间质化纤维程度较其他组均为最低,细胞迁移率、移植物体积及质量保留率、CD31蛋白表达程度均优于其他组别并伴有大量新生毛细血管。但本研究存在样本量偏少、未进行人体试验等不足,研究结果可能存在一定偏倚,有待通过大样本研究进一步讨论。

4 结论

改良型富血小板纤维蛋白促进脂肪移植存活的最适混合比例是1：12,其促进脂肪移植物存活的机制可能是减轻移植物炎症反应、刺激移植物新生血管生成及减少间质化纤维程度。