高龄与血清学筛查高风险孕妇产前胎儿染色体异常及亚显微不平衡状态的比较分析

周颖，徐玲玲，张莉超，施丹华，李海波

妊娠中期羊水细胞染色体核型分析是产前诊断和及时终止异常妊娠的重要预防手段，是产前诊断染色体数目和结构异常的常用技术之一，并被认为是细胞学诊断的“金标准”[1]。然而，常规的染色体核型分析报告周期长，羊水细胞需要培养1 周甚至更长时间；而且，DNA基因组中5 Mb以下的染色体拷贝数异常（copy number variant，CNV），即亚显微不平衡状态，无法通过该技术进行分辨[2]。但是，CNV同样可以导致发育迟缓、智力障碍、精神行为异常等严重出生缺陷。染色体微阵列分析（chromosome microarray analysis，CMA）对于染色体亚显微不平衡状态的诊断具有明显优势，可显著提高微缺失、微重复的诊断率[3]，作为新的分子遗传学产前诊断技术，是传统核型分析很好的补充。本研究通过对2 497例高龄孕妇和1 891 例血清学筛查高风险孕妇行羊水细胞染色体核型分析及CMA 检测，比较分析两组染色体数目异常、结构异常、嵌合体情况及亚显微不平衡状态，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 回顾性收集2020 年1 月至2022 年12 月在宁波市妇女儿童医院就诊的各种高危孕妇，并同时进行产前胎儿染色体核型分析和CMA 检测的孕妇。纳入标准：（1）高龄孕妇，包括仅高龄和高龄合并不良生育史孕妇；（2）血清学筛查高风险孕妇包括21 三体高风险、18 三体高风险和开放性神经管畸形（NTD）高风险的孕妇，其中21 三体高风险包括仅21 三体高风险、21 三体高风险合并超声异常及21 三体高风险合并不良孕产史；（3）NTD 高风险包括仅NTD 高风险和NTD 高风险合并DS 高风险；（4）超声软指标异常包括NT 增厚（≥3.0 mm），心室强光点，侧脑室增宽及高龄合并超声软指标异常；（5）无创异常包括无创异常合并21 三体高风险及无创异常合并高龄；（6）超声异常包括超声异常合并不良孕产史及超声异常合并高龄；（7）夫妇染色体异常包括高龄合并夫妇染色体异常；（8）其他指夫妇一方确诊地中海贫血，孕妇孕期高热、用药及智力低下等。其中孕周19 ～23 周、高龄（年龄≥35 岁）孕妇2 497 例，血清学筛查高风险孕妇1 891 例纳入本研究。本研究获得宁波市妇女儿童医院医学伦理委员会批准，所有研究对象均同意参加本研究并签署书面知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 羊水采集 孕妇排空膀胱取仰卧位，常规消毒、超声监视下经腹壁行羊膜腔穿刺术，抽取35ml羊水，分装4 管（FALCON无菌离心管），两管进行染色体核型分析，一管进行CMA检测，剩余一管5ml保存备用。

1.2.2 染色体核型分析 按照本院出生缺陷防治实验室建立的常规细胞培养法培养、收获、制片和G 显带分析核型，必要时进行C 显带和N 显带分析。核型描述依据人类细胞基因组学国际命名体系（ISCN2016）。

1.2.3 CMA 检测及结果解释 采用Affymetrix Cytoscan 750K Array 芯片（美国Affymetrix 公司产品）检测，参照在线公共数据库（DGV 数据库、DECIPHER数据库、OMIM数据库、UCSC数据库等）对CNV 的数据进行分析。参照美国医学遗传学和基因组学学会（ACMG）的标准，将CMA 检测结果分为致病性（P）、可能致病性（LP）、临床意义不明性（VUS）、可能良性（LB）和良性（B）5 个级别[4]，并结合上述数据库、相关文献和超声检查结果，系统评价CNV 的临床意义。

1.3 统计方法 采用SPSS 22.0 统计软件进行分析，计数资料采用2检验或Fisher 确切概率法。P ＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2497 例高龄组染色体核型及CMA 检测结果 2497 例高龄孕妇共检出各种异常211 例，总体异常检出率为8.45%。其中数目异常32 例（1.28%），包括21三体20例、18三体3例、47，XXX 2例、47，XXY 4 例、47，XYY2 例、47，XN，+mar1 例；结构异常12 例（0.48%），其中平衡易位10 例，见表1；大片段缺失重复2 例；嵌合体7 例（0.28%），见表2。10 例平衡易位和5 例嵌合体（包括嵌合比例＜10%和平衡易位嵌合）CMA 均未见异常。CMA 提示CNV160 例，其中27 例评估为致病性CNV，9 例评估为可能致病性CNV，P 或LP CNV 的检出率为1.44%，见封三彩图1，124 例评估为VUS，核型分析均未见明显异常。

表1 羊水细胞染色体核型分析检出的平衡易位

表2 两组嵌合体具体类型及妊娠结局

图1 高龄组P或LP亚显微不平衡状态检出情况

2.2 1 891 例血清学筛查高风险组核型及CMA 检测结果 1 891 例血清学筛查高风险孕妇共检出各种异常178 例（9.41%）。其中数目异常50 例（2.64%），包括21 三体30 例、18 三体14 例、13 三体1 例、47，XXX 1 例、47，XXY 1 例、47，XYY 1 例、45，X 1 例、69，XXX 1 例；结构异常6 例（0.32%），包括平衡易位3 例，见表1；大片段缺失重复3 例；嵌合体5 例（0.26%），见表2。同样，3 例平衡易位CMA 均未见异常。CMA 提示CNV117 例，其中致病性变异31 例，P或LPCNV检出率为1.90%，见封三彩图2，81 例评估为VUS，核型分析均未见明显异常。高龄组与血清学筛查高风险组数目异常、P 或LP 差异均有统计学意义（均P ＜0.05），见表3。

表3 两组各种异常检出率比较

图2 血清学筛查高风险组P或LP亚显微不平衡状态检出情况

2.3 高龄组妊娠结局 32 例非整倍体胎儿，其中20例21 三体，3 例18 三体，1 例标记染色体胎儿均终止妊娠，8 例性染色体非整倍体胎儿均足月活产娩出，出生后42 d 随访未见明显异常。

36 例携带P 或LP CNV 胎儿经产前遗传咨询，有33 例选择终止妊娠，另外3 例均足月活产娩出，未见明显异常。携带VUS CNV 的胎儿124 例，有2例选择终止妊娠，经父母双方外周血验证，证实变异遗传自母亲。继续妊娠的孕妇，有3 例进行父母双方外周血验证，证实2 例遗传自父亲，1 例为新发。7例嵌合体中有2 例选择终止妊娠，见表2。

2.4 血清学筛查高风险组妊娠结局 50 例非整倍体胎儿，其中30 例21 三体，14 例18 三体，1 例13三体，1 例69，XXX 胎儿均终止妊娠，4 例性染色体非整倍体胎儿均足月活产娩出，出生后42 d 随访未见明显异常。

36 例携带P 或LP CNV 胎儿经产前遗传咨询，有29 例选择终止妊娠，另外7 例均足月活产娩出，未见明显异常。携带VUS CNV 的胎儿81 例，均选择继续妊娠，其中有3 例进行父母验证，证实2 例变异来自母亲，1 例来自父亲。5 例嵌合体中只有1 例Y 染色体缺失嵌合者选择继续妊娠，其余均终止妊娠，见表2。

3 讨论

高龄孕妇中胎儿发生染色体异常的可能性增加[5]，因为女性自35 岁起卵巢功能逐渐退化，卵子逐渐老化，生殖细胞在减数分裂或受精卵在有丝分裂时较容易发生染色体不分离或其他畸变。所以我国《母婴保健法实施办法》明确指出，孕妇预产期年龄超过35 周岁（高龄孕妇）是产前诊断的适应证。本研究结果显示高龄组核型检出异常以非整倍体为主，检出各种非整倍体32 例，占核型分析总异常的62.74%（32/51）；血清学筛查高风险组检出非整倍体50 例，占核型异常的81.97%（50/61）。这说明血清学筛查对染色体非整倍体异常有较高的提示作用，通过血清学筛查可提高胎儿染色体非整倍体的检出率。血清学筛查高风险组检出数目异常和结构异常共61 例，检出率为3.23%（61/1 891），与文献[6-7]报道相符，这说明血清学筛查是确定胎儿染色体疾病风险较好的方法，但其受孕龄、孕妇体质量、血清中AFP及HCG等多种因素的影响，存在较高的假阳性率及假阴性率[8]，需进一步进行羊水穿刺来确诊筛查结果，临床医生需结合血清学筛查高风险孕妇自身情况，给予合适的产前诊断方案。

本研究针对高龄和血清学筛查高风险孕妇采用产前胎儿羊水的核型分析联合CMA 检测，以标准核型分析分辨率＞10 Mb 设定检测，对两者在染色体异常及亚显微不平衡状态进行比较分析。高龄组检出非整倍体胎儿32 例（1.28%），CMA 额外检出携带P 或LP CNV 胎儿36 例，检出率提高1.44%。血清学筛查高风险组检出非整倍体胎儿50 例（2.64%），CMA 额外检出携带P 或LP CNV 胎儿36 例，检出率提高1.90%，这说明核型分析联合CMA 检测可以提高异常的检出率，符合前期的研究报道[3]。有研究报道，P 或LP CNV 在有超声结构异常的胎儿中检出率可达6%～7%[9]，在无超声结构异常且核型正常的胎儿中检出率为1%～1.7%[10]。本研究检出P 或LP CNV高龄组与以往研究一致，血清学筛查高风险组略有升高，分析可能与检测人群的数量及遗传背景差异和检测平台的不同有关。对于评价为VUSCNV 的检出情况，两组均明显高于胡睿等[11]研究报道的1.03%和Wang等[12]研究报道的1.74%，分析也可能与检测平台差异有关。产前VUSCNV 报告不仅会增加临床医生遗传咨询工作的难度，同时，还会给胎儿父母带来很大的心理负担。本研究两组孕妇经随访发现，有2 例发生非医学需要的终止妊娠。对携带VUSCNV 群体的随访观察，进行系统的表型与基因型关系研究，可以为产前诊断VUS CNV 报告提供更多的参考信息。

CMA 检测技术与传统的染色体核型分析相比具有显著优势，如无需培养，报告周期短，分辨率高，可识别基因组亚显微结构异常，但其在识别嵌合体和染色体平衡性结构异常方面存在一定局限性。在嵌合体检出方面，CMA对于低于30%的嵌合体识别较差[13]。本研究两组羊水细胞染色体核型分析额外检出3 例数目异常的低比例嵌合体，嵌合比例低于10%。平衡性结构异常方面，本研究染色体核型分析在两组中共检出15 例平衡异位携带者（包括2 例嵌合体）。因此，针对嵌合型非整倍体和平衡易位的遗传咨询，需结合CMA 和染色体核型分析进行综合评估。

利益冲突 所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明 周颖：实验设计、采集数据、数据分析、论文撰写；徐玲玲：实验设计、采集数据；张莉超：实施研究、采集数据；施丹华：实验设计、论文修改；李海波：经费支持、研究指导