CKMT2 对结直肠癌发生发展的影响

蔡莎莎，喻长法，段达荣，刘炳辉，廖南生，陈文晓

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是一种消化系统恶性肿瘤，它的发病率和死亡率在全世界恶性肿瘤中排名第三位，已成为困扰全球的主要健康问题之一[1-2]。十余年来，我国CRC 的发病率与死亡率持续攀升[3-4]，给社会及医疗机构带来沉重的压力。随着肿瘤标志物、肠镜等筛查手段的进展以及CRC根治手术的不断改进，早期CRC患者的5 年生存率得到大大改善，但是大多数患者诊断时已处于中晚期阶段，预后较差。肌酸激酶线粒体2（creatine kinase mitochondrial 2，CKMT2），属于肌酸激酶（creatine kinase，CK）同工酶家族[5-6]。本研究旨在分析CKMT2在CRC 组织中的表达，探讨其与CRC 发生发展的关系及其可能调控机制，为CRC早期肿瘤标志物的筛选提供参考，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2018 年1 月至2022 年12 月于台州市第一人民医院行手术治疗的149 例CRC患者。收集其肿瘤组织和远端癌旁组织标本，各自放入冻存管，然后迅速置于液氮环境中，保存至-80℃。本研究获得台州市第一人民医院伦理委员会批准，所有研究者均同意参加本研究并签署书面知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和细胞转染 对人CRC 细胞株SW480 及其对照细胞株NCM460（上海富恒生物科技有限公司）进行培养，达到80%左右细胞密度，使用Lipo3000 和Opti-MEM 培养基进行转染（赛默飞世尔科技公司）。转染分组：转染阴性对照NC siRNA的为NC 组（对照组），转染CKMT2 siRNA 的为siCKMT2 组（上海吉玛公司）。转染48 h 后，实时荧光定量PCR（qRT-PCR）方法验证转染效果。

1.2.2 qRT-PCR 组织标本研碎或者收集细胞，提取总RNA；再进行逆转录反应合成cDNA，最后以cDNA 为模板，采用美国Applied Biosystems 7300 plus 实时荧光定量PCR 仪检测mRNA 表达水平（TaKaRa 公司）。CKMT2 引物序列为：上游5’-ACGAGGCTGGGAGTTCAT-3’，下游5’-CACGCTT CTGGAGTCTTAGGTT-3’；Myc 引物序列为：上游5’-GGCTTTATCTAACTCGCTGTA-3’，下游5’-TA TGGGCAAAGTTTCGTG-3’。

1.2.3 Western Blot 收集处理后的细胞，并提取总蛋白，蛋白浓度调整至1g/l。再用上海碧云天生物技术有限公司的试剂盒检测。相关抗体购自Abcam 公司。

1.2.4 免疫共沉淀 在细胞处理完毕后，使用含有1 mmol/L 的PMSF、1%蛋白磷酸酶抑制剂混合物的Co-IP 细胞裂解缓冲液，并在冰上裂解细胞30 min。再将裂解液离心，收集上清液，加入30l 蛋白A/G CoIP 磁珠，4 ℃缓慢摇晃30 min。然后收集上清液，加入兔抗CKMT2、小鼠抗Myc 抗体孵育，4℃缓慢摇晃孵育过夜。之后加入30l 蛋白A/G CoIP 磁珠，4 ℃缓慢摇晃4 h，收集磁珠并用裂解缓冲液清洗3 次，1×SDS上样缓冲液洗脱，100 ℃加热5 min，然后进行Western Blot 检测。

1.3 统计方法 采用SPSS 22.0 软件进行统计分析。非正态分布的计量资料以中位数（四分位间距）表示，组间比较采用Mann-Whitney U 检验；计数资料比较采用2检验或Fisher’s检验；借助Kaplan-Meier法生成生存曲线。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CKMT2 在结直肠癌中的表达 149 例结直肠癌组织中CKMT2 mRNA 表达水平[3.72（1.93，8.61）]明显高于癌旁组织[1.12（0.61，1.75）]，差异有统计学意义（Z=10.421，P ＜0.05）；CRC 细胞株中CKMT2 mRNA 的表达水平明显高于对照细胞株（t=17.69，P ＜0.05），见图1。

图1 CKMT2 在CRC 中的表达

2.2 CKMT2 表达水平与CRC 患者临床病理特征的关系 根据CKMT2 表达水平是否高于表达中位数，分为≤中位数组和＞中位数组。两组年龄、性别、肿瘤部位、病理类型、分化程度和TNM 分期差异均无统计学意义（均P ＞0.05），见表1。

表1 不同CKMT2 水平患者的临床特征 例

2.3 CKMT2 与结直肠癌患者生存结局的关系 对纳入患者进行随访，随访截止时间为2023 年6 月30日，根据中位数将CKMT2 分为＞中位数组和＜中位数组，用Kaplan-Meier 方法生成生存曲线。结果显示CKMT2 ＞中位数组与＜中位数组比较，总体生存率明显降低（P ＜0.05），见图2。

图2 CKMT2 不同表达水平患者总体生存率比较

2.4 CKMT2 正向调控Myc的表达 通过使用qRTPCR技术对来自25 例CRC患者的临床组织样本进行研究，发现结直肠癌组织Myc 基因表达量[14.56（4.06，52.72）]明显高于周围正常组织[1.30（0.25，3.47）]，差异有统计学意义（Z=4.084，P ＜0.05），见图3A。Spearman 相关性分析揭示出，CRC 组织中CKMT2 的表达水平与Myc 表达水平呈正相关（r=0.478，P ＜0.05），见图3B。

图3 结直肠癌患者Myc 表达水平及其与CKMT2 表达水平的相关性

2.5 细胞转染 结直肠癌细胞株SW480 转染siCKMT2 后，qRT-PCR 法检测siCKMT2 转染效果，结果发现siCKMT2 组的CKMT2 mRNA 表达水平明显低于NC 组（t=5.011，P ＜0.05），表明siCKMT2 转染有效。在此基础上检测siCKMT2 组和对照组Myc的表达水平，结果发现siCKMT2 组Myc 的表达水平明显低于对照组，差异有统计学意义（t=4.520，P＜0.05），见图4A。Western blot 显示，Myc 蛋白在转染siCKMT2 后也显著下调，见图4B。

图4 SW480 细胞株转染siCKMT2 后Myc 表达水平

2.6 免疫共沉淀结果 在SW480 细胞内，可以从CKMT2 的免疫沉淀产物中检测到Myc 蛋白，同时也可以在Myc 的免疫沉淀产物中发现CKMT2 蛋白。对于IgG 的免疫沉淀产物，无论是CKMT2 还是Myc 都无法被检出，见图5。

图5 免疫共沉淀方法检测CKMT2 与Myc的结合情况

3 讨论

CKMT2 基因位于人类染色体5q13.3，是一种线粒体肌酸激酶，广泛分布于细胞线粒体内膜和外膜间隙，主要参与细胞内能量转运、肌肉收缩、丙酮酸代谢、三磷酸腺苷合成等生物学过程[7]。Wang 等[8]鉴定了骨肉瘤中3 856 个差异表达基因和250 个显著表达的microRNAs，发现CKMT2 与抑癌基因p53、表皮生长因子受体（EGFR）、基质金属蛋白酶（MMP）等相关，通过调控血管生成、迁移和侵袭参与骨肉瘤的生长发育。Ye 等[9]根据癌症基因组图谱（TCGA）407 个样本和（GEO）数据库433 个样本的数据，构建了包含CKMT2 在内的13 个代谢相关基因的预后模型，用于胃腺癌（STAD）的预后预测。有学者研究了CKMT2 在18 例结直肠癌患者中的表达，通过二维液相色谱-质谱联用分析、Western Blot、免疫组化分析验证了CKMT2 在结直肠癌中的高表达[10]。本研究通过使用qRT-PCR 技术对来自149 例CRC组织的标本进行数据分析，发现癌组织CKMT2 mRNA 表达水平明显高于癌旁组织（P ＜0.05）；且研究发现CKMT2 高水平组的总体生存率明显降低（P ＜0.05），说明CKMT2 与患者生存结局有关，能提示CRC 患者预后。

原癌基因Myc 编码一个转录因子家族，是人类肿瘤中最常见的活化癌蛋白之一。在人类绝大多数癌症中都会发生Myc 异常或者与Myc 途径相关的上调机制。Myc 蛋白是细胞程序的主要调节因子，在肿瘤相关的多种生物学功能中发挥调控作用[11-12]。常琳[13]研究发现，LINC00941 通过影响miR-205-5p的表达，正向调控Myc 的表达，从而促进结肠肿瘤的发生和进展。Jing 等[14]的研究发现，凝缩蛋白复合物II 亚基D3（NCAPD3）通过上调c-Myc 的水平，并与c-Myc相互作用，增强了细胞的有氧糖酵解（Warburg 效应），从而影响结直肠癌的发生发展。本研究发现，CKMT2 表达水平与Myc 表达水平呈正相关（r=0.478，P＜0.05）；转染siCKMT2 后，qRT-PCR和Western blot 检测发现CRC 细胞株中Myc mRNA 和Myc 蛋白水平均下降，提示CKMT2 正向调控Myc。本研究还采用免疫共沉淀方法验证了CKMT2 与Myc 之间的相互作用关系，进一步证实了CKMT2通过Myc 调控结直肠癌的可能机制。

综上所述，本研究揭示了CKMT2 在CRC 组织和细胞系中的表达水平均升高，高水平的CKMT2 可能预示患者的不良预后，CKMT2 可能通过促进Myc对结直肠癌的发生和进展起到调控作用。CKMT2可能成为一个新的生物标志物和治疗靶点。

利益冲突 所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明 刘炳辉：实验操作；蔡莎莎、喻长法：论文撰写、经费支持；段达荣、廖南生：数据整理、统计学分析；陈文晓：研究指导、论文修改