肺腺癌组织转化生长因子β1、鼠双微体2表达变化及其与患者临床病理特征的关系

韩晓丽，黄景涛，赵宝山，孙光蕊，朱翠敏，梁宗英

1 承德医学院附属医院胸外科，河北承德 067000；2 承德医学院附属医院肿瘤放化疗科

肺癌是全世界范围内发病率和病死率最高的肿瘤，约占肿瘤总病死率的20%［1］。肺腺癌是肺癌最常见的病理类型，也是非小细胞肺癌的病理类型之一。肺腺癌患者预后普遍较差，且具有遗传易感性。转化生长因子β1（TGF-β1）基因定位于染色体19q3，其配体存在于多种细胞表面，与多种肿瘤密切相关。TGF-β1经横跨细胞膜的丝/苏氨酸激酶受体发出，使Smad蛋白磷酸化，并将信号传导至细胞核，通过激活靶基因转录而发挥作用［2］。在肿瘤进展过程中，这种作用模式会影响上皮或间质蛋白表达，促进癌细胞发生上皮—间质转化（EMT），从而促进肿瘤转移。鼠双微体2（MDM2）是E3泛素连接酶RING家族成员之一，参与多种人体生命活动，包括肿瘤的发生和发展［3］。MDM2在肺腺癌组织中表达升高，与肺癌的进展和化疗耐药性等多个机制有关。2020年9月—2022年3月，本研究观察了肺腺癌组织中TGF-β1和MDM2的表达变化，并探讨二者与患者临床病理参数的关系，为研究肺腺癌发生发展相关的新型肿瘤标志物提供依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 纳入标准：①经外科手术切除且病理检查确诊为肺腺癌；②术前未接受过放化疗及免疫治疗；③临床资料完整。排除标准：①伴有严重感染或肝、肾功能严重异常；②合并其他恶性肿瘤或存在其他恶性肿瘤病史；③手术切除术后、术后辅助治疗开始前出现疾病复发、进展甚至死亡。选取同期我院收治并符合上述标准的肺腺癌患者60例，术中收集其肺腺癌组织和癌旁正常肺组织（距癌组织边缘＞6 cm，病理证实为正常组织）各60例份。60例肺腺癌患者中，男21例、女39例，≥60岁36例、＜60岁24例，吸烟22例，TNM分期：Ⅰ期25例、Ⅱ期22例、Ⅲ期13例，组织学分级：高分化10例、中分化41例、低分化9例，局部淋巴结转移23例。本研究通过承德医学院附属医院伦理委员会批准（LL2021028），患者及家属均签署知情同意书。

1.2 肺组织TGF-β1、MDM2蛋白检测 ①定位检测：采用免疫荧光法。将肺腺癌组织和癌旁正常肺组织脱水后石蜡包埋，连续5 μm厚度切片；烤片机65 ℃烤片120 min，常规脱蜡水化，PBS清洗，微波抗原修复打开甲醛固定造成的交联键暴露抗原表位，10%山羊血清封闭；加入TGF-β1、MDM2一抗（稀释比例分别为1∶ 100、1∶ 300），4 ℃孵育过夜。第二天温箱复温45 min，PBST清洗（曲拉松0.1%），加入荧光二抗，37 ℃孵育1 h，PBST清洗。避光条件下，使用DAPI试剂对细胞核染色，室温条件下PBST清洗3 min × 3次；滴加抗荧光淬灭剂，中性树脂稀释后，封片固定。荧光免疫结果判定：荧光显微镜下根据荧光的分布位置及强度，确定相应抗原是否存在及其所在部位。TGF-β1蛋白使用Alexa Fluor 488-conjugated羊抗兔荧光抗体标记信号显绿色，MDM2使用ATTO 594-conjugated羊抗鼠荧光抗体标记信号显红色，细胞核使用DAPI染色标记信号显蓝色。每张标本随机取5个不重复的高倍视野，按照荧光强度确定蛋白定位。②半定量检测：采用免疫组化法。将肺腺癌组织和癌旁正常肺组织脱水后石蜡包埋，连续5 μm厚度切片，冰冻切片恢复至室温，60 ℃烤箱烤片30 min～1 h，或80 ℃烤片15～20 min。将石蜡切片常规脱蜡复水，微波炉火力修复，自然冷却或放入通风橱中冷却至室温，PBS漂洗5 min × 3次。3%过氧化氢消除内源性过氧化物酶活性，37 ℃条件下加入10%山羊血清封闭45 min，加入TGF-β1、MDM2一抗（稀释比例分别为1∶ 100、1∶ 300），4 ℃孵育过夜，BSA代替一抗作为阴性对照；第二天37 ℃复温45 min，PBS漂洗5 min × 3次；滴加通用型酶标山羊抗小鼠/兔IgG聚合物，37 ℃温箱孵育20 min，PBS漂洗5 min × 3次。滴加配置好的DAB染色剂，并进行镜下实时观察，以控制最合适的显色时间。流水冲洗10 min，超纯水浸泡1 min，苏木素复染细胞核，依次梯度乙醇脱水，二甲苯透明。将中性树脂用二甲苯稀释至合适浓度，封片固定。免疫组化结果判定：每张切片在光学显微镜下连续观察10个高倍视野，以细胞核与细胞质中呈现棕黄色定义为阳性，计算阳性率，阳性率＜5%为0分、5%～＜25%为1分、25%～＜50%为2分、50%～＜75%为3分、≥75%为4分；按照着色强度评分：无色为0分、淡黄色为1分、棕黄色为2分、棕黑色为3分；两项评分相乘，0～3为阴性，＞3为阳性。

1.3 统计学方法 采用SPSS25.0统计软件。计数资料以n（%）表示，结果比较采用χ2检验。肺腺癌组织中TGF-β1、MDM2蛋白表达的关系采用Spearman等级相关分析法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺腺癌组织和癌旁正常肺组织TGF-β1、MDM2蛋白定位情况 与癌旁正常肺组织比较，肺腺癌组织中TGF-β1、MDM2蛋白均呈过表达状态，TGF-β1大量表达于细胞质、少量表达于细胞核，MDM2绝大多数表达于细胞质。见OSID码图1。

2.2 肺腺癌组织和癌旁正常肺组织TGF-β1、MDM2蛋白阳性表达率比较 肺腺癌组织TGF-β1蛋白阳性表达42例份（70.00%）、MDM2蛋白阳性表达47例份（78.33%），癌旁正常肺组织分别为24例份（40.00%）、24例份（40.00%）；肺腺癌组织TGF-β1、MDM2蛋白阳性表达率均高于癌旁正常肺组织（P均＜0.05）。见OSID码图2。

2.3 不同临床病理特征的肺腺癌患者癌组织TGF-β1、MDM2蛋白阳性表达率比较 不同性别、年龄、吸烟情况的肺腺癌患者癌组织TGF-β1、MDM2蛋白阳性表达率比较差异均无统计学意义（P均＞0.05）。淋巴结转移、TNM分期为Ⅲ期及低分化的肺腺癌患者癌组织TGF-β1、MDM2蛋白阳性表达率均高于无淋巴结转移、TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期及高中分化者（P均＜0.05）。见表1。

表1 不同临床病理特征的肺腺癌患者癌组织TGF-β1、MDM2蛋白阳性表达情况比较［例（%）］

2.4 肺腺癌组织中TGF-β1、MDM2蛋白表达的关系 肺腺癌组织中TGF-β1、MDM2蛋白表达呈正相关关系（r= 0.539，P＜0.05）。见表2。

表2 肺腺癌组织中TGF-β1、MDM2蛋白表达的相关性分析结果

3 讨论

肺癌早期症状并不明显或典型，其诊断标志物尚不明确，导致检出率较低，部分患者被发现时已处于中晚期。而肺癌转移往往在早期就已发生，导致其病死率一直居高不下。因此，深入研究肺癌的生物学机制，及时有效地发现早期诊断标志物意义重大。

TGF-β1本质上是个多功能的多肽细胞因子，在早期胚胎发育和成人体内代谢平衡的维持中发挥重要作用。TGF-β1主要以复合物的形式存在于细胞外基质中，只有被激活才能与受体结合发挥功能［4］。研究表明，TGF-β信号失调与肿瘤发生有关，且其在肿瘤发生中的作用有明显双向性，在癌前细胞中是肿瘤抑制因子，在癌细胞中是肿瘤促进因子［5］。TGF-β参与肿瘤发生的典型通路为TGF-β/Smad通路，被外来信号刺激的TGF-β1配体结合并激活由Ⅰ型/Ⅱ型丝氨酸/苏氨酸受体（TGF-βRⅠ/Ⅱ）组成的四聚体复合物，激活的TGF-βRⅠ/Ⅱ随即磷酸化其下游的R-SmadS （Smad2和Smad3），Smad2和Smad3进一步与 Smad4结合，形成Smad2/3/4复合体后共同移位进细胞核，结合到特定DNA区域发挥作用［6］。研究显示，TGF-β1作为促癌因子，通过该通路经诱导EMT的方式促进乳腺癌［7］、肝癌［8］、宫颈癌［9］和甲状腺癌［10］等多种肿瘤进展，但其在肺腺癌中的报道较少。FAN等［11］研究发现，长链非编码RNA lnc01137可靶向增强TGF-β1Ⅰ型受体（TbRⅠ）的多泛素化和蛋白酶体降解，从而抑制TGF-β1/Smad信号通路传导，阻断肺腺癌的EMT转化。WU等［12］研究显示，lnc00941通过直接结合Smad4蛋白的MH2结构域来阻止Smad4蛋白降解，并与β-TrCP竞争性激活EMT，从而激活TGF-β/Smad2/3信号通路，加速结肠癌裸鼠的肺转移。除此之外，被有丝分裂蛋白激酶PLK1磷酸化的波形蛋白会进一步激活TGF-β1信号通路，这能使磷酸化Smad2/3蛋白募集到细胞程序性死亡配体1（PD-L1）启动子上，激发PD-L1产物的转录和翻译，同时催化肺腺癌发生EMT和免疫逃逸［13］。在TGF-β1的诱导下，PLK1还可以结合并磷酸化β-catenin第311位丝氨酸，使β-catenin稳定性增强，并与E-钙黏蛋白分离，推动非小细胞肺癌中EMT的发生［14］。本研究结果显示，肺腺癌组织中TGF-β1呈过表达状态，且其高表达与肺腺癌患者的TNM分期、分化程度及淋巴结转移有关，这提示TGF-β1促进了肺腺癌的发生，同时可能推进了肺腺癌的恶性转化和转移。

MDM2作为一个E3泛素连接酶，因与肿瘤抑制因子p53存在特异性泛素化结合位点而成为最重要的p53负性调节因子，其含有的环指结构可促进p53从细胞核向细胞质转移，从而减少p53转录，而其N端则存在结合位点标记p53，诱导p53的泛素化降解。MDM2在多种肿瘤中过表达，是主要的凋亡抑制蛋白之一，通过参与周期阻滞、细胞凋亡和DNA损伤修复等途径促进肿瘤的迁移和侵袭。研究显示，MDM2抑制剂处理的弥漫性大B淋巴瘤组织细胞周期阻滞在G1期，细胞凋亡率升高、细胞增殖能力受限，同时伴有p53蛋白表达升高［15］。MDM2对肿瘤的诱导作用可能还与基因扩增有关。LI等［16］研究发现，核糖体蛋白S27a（RPS27a）与RPL11在肺腺癌细胞p53的激活调控中存在相互作用，敲低RPS27a能在减弱该相互作用的同时，增强RPL11与MDM2结合，从而抑制MDM2对p53的泛素化降解，稳定p53，诱导肺腺癌细胞活力被抑制、细胞周期阻滞和细胞凋亡。本研究结果显示，肺腺癌组织中MDM2阳性表达率升高，并且与肺腺癌患者的TNM分期、分化程度及淋巴结转移有关，这提示MDM2可能通过某种途径促进了肺腺癌细胞的恶性转化，使其有了更强的侵袭和转移能力。

既往研究表明，TGF-β1可通过Smad依赖的方式激活MDM2，诱使其表达升高；MDM2也可激活信号通路中Smad的磷酸化水平，促进肺腺癌细胞增殖和EMT，而TGF-β1是主要的EMT诱导因子，因此EMT节点蛋白可能是二者联系的桥梁［17］。TGF-β1最重要的靶分子之一Snail是E-钙黏蛋白的强阻遏因子。Snail蛋白氨基末端存在一个高度保守的SNAG转录阻遏结构域，可特异性结合靶基因上游调控区，以起到特异性抑制基因转录的作用。因此，Snail作为转录抑制因子在肺癌等多种肿瘤中存在异常表达。国外研究报道，Snail的SNAG结构域可以与E-钙黏蛋白的CDH1启动子区域偶联，通过和组蛋白脱乙酰酶（HDAC）形成多分子复合物，从而阻滞E-钙黏蛋白转录而抑制其表达［18］。TGF-β1异常激活可促进Snail表达，进而使E-钙黏蛋白表达降低，而沉默MDM2会使E-钙黏蛋白表达升高和EMT进程受阻，提示二者在肿瘤发生发展中的作用存在联系。目前，关于TGF-β1和MDM2是否存在直接联系鲜见报道。本研究结果显示，肺腺癌组织中TGF-β1和MDM2的表达呈正相关关系。这说明TGF-β1和MDM2或许相互影响，共同促进肺腺癌的发生和恶性转化。其机制有两种可能：一是TGF-β1可能存在特异性泛素化结合位点，受MDM2泛素化调节而影响肿瘤进程，两者同时高表达可能是相互促进的结果；二是TGF-β1在肺腺癌中的过度表达可通过异常激活Smad，使得MDM2表达增加，同时影响E-钙黏蛋白和Snail的功能及表达情况，使肺腺癌细胞进一步发生EMT，进而导致肺腺癌恶性进展的表观遗传学基础。

综上所述，肺腺癌组织中TGF-β1、MDM2蛋白阳性表达率均升高，且淋巴结转移、TNM分期为Ⅲ期及低分化的肺腺癌组织升高更明显，二者可能共同参与了肺腺癌的发生发展，但其具体机制仍有待进一步研究，本研究结果或可为肺腺癌分子靶向治疗提供新的理论支持。